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vom Gen zum rekombinanten Wirkstoff

Schritte, Vorteile und Nachteile von Expressionssystemen

Schritte, Vorteile und Nachteile von Expressionssystemen

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C. M.
Study
C. M.
Diese Lernkarten bieten einen Überblick über die Produktion rekombinanter Wirkstoffe, geeignet für Universitätsniveau. Sie behandeln die Rolle von DNA, RNA und Proteinen, sowie die Verwendung verschiedener Zellsysteme wie Säuger-, Bakterien- und Hefezellen für die Proteinproduktion. Die Karteikarten vergleichen die Vor- und Nachteile dieser Systeme, einschließlich Aspekten wie Kosten, Wachstumsgeschwindigkeit und posttranslationale Modifikationen. Sie richtet sich an Studierende und Forscher, die sich mit Biotechnologie und molekularer Biologie befassen, um ein tieferes Verständnis der Prozesse von der Genexpression bis zur Herstellung rekombinanter Proteine zu erlangen.
Flashcards
12
Students
0
Language
German
Category
Biology
Level
University
Created / Updated
18.07.2016 / 20.07.2016
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Flashcards

1. Transkription DNA -> mRNA durch RNA-Polmerasen

  • gesamter RNA-Pool der Zelle zu der Zeit
  • Fixierung der mRNA aus Gesamt-RNA:
    • eukaryontische mRNAs enden immer mit Polyadenin (poly(A))-Schwanz
    • Hybridisierung des poly(A)-Endes an stationäres poly(T)
    • anschließende Eluierung

2. reverse Transkription ("Umschreiben") der mRNA in copy-DNA (cDNA)

  • Oligo-Desoxythymidin-Primer an poly(A)-Ende -> poly(dT)-Stretch=Starter für reverse Transkription
  • analog enzymatischer DNA-Synthese, nur mit sog. RNA-abhängiger DNA-Polymerase, auch Reverse Transkriptase (DNA-Polymerase, die RNA als Matrize akzeptiert)
  • ->RNA/DNA-Hybrid
  • enzymatischer Abbau RNA-Teil (RNAse H)
  • Synthese vom zweiten DNA-Strang komplementär zum ersten (normale DNA-abhängige DNA-Polymerase)

3. Gen-spezifische PCR

  • PCR mit für Zielgen spezifischen Primern (Isolation gewünschter cDNA aus Gesamt-cDNA)
  • schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen (palindromisch-überhängende Enden)
  • Kombination mit geeignetem Promotor (wirtspezifisch) -> Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterasebindung) = Ligation

4. Amplifizieren ("Vervielfältigung") von rekombinierten DNA-Molekülen

  • Amplifizierung rekombinierter Einzelmoleküle durch Bakterienzellen
  • keine Signalsequenz für DNA-Replikation in zu replizierender DNA -> Platzierung in Plasmide
  • Amplifizierung der Plasmide in Bakterienzellen

Vorteile E.coli als "Klonier-Bakterium"

  • repliziert Plasmide natürlicherweise
  • nicht pathogen
  • Genom komplett bekannt
  • umfangreiche Erfahrung der Genetik
  • nimmt leicht DNA auf
  • schnelles Wachstum
  • einfache Handhabung

Anforderungen an industriell nutzbares Expressionssystem

  • hohe Proteinausbeute
  • authentisches Protein
    • naturidentische Aminosäuresequenz
    • korreke Tertiärstruktur
    • korrekte posttranslationale Modifikationen
  • steuerbare Expression
  • möglichst einfache Reinigung des Produktes
    • Sekretion in Kulturmedium
  • Abwesenheit Pathogene
  • Abwesenheit Pyrogene
  • möglichst geringe Produktionskosten
    • kurze Fermentationszeiten
    • geringe Fermentationskosten
    • kostengünstige Medien
  • Möglichkeit zum "upscaling" (vom Versuchs- zum Produktionsmaßstab)

Vorteile von Hefen für die Proteinproduktion (Saccharomyces cerevisiae - Bäckerhefe)

  • echter Eukaryont
  • schnelles Wachstum
  • umfangreiche Erfahrung mit Hefe-Genetik
  • Genom vollständig bekannt
  • Zellen und deren Produkte sind nicht pathogen
  • Zellen produzieren keine Pyrogene
  • meist korrekte Faltung der exprimierten Proteine
  • zum Teil hohe Proteinausbeuten
  • Sekretion in das Kulturmedium
  • einige posttranslationale Modifikationen sind machbar
  • biologisch sicher (genetically recognized as safe, GRAS)
  • nimmt relativ leicht DNA auf
  • einfache Handhabung
  • kostengünstige Medien

Stärken von Pflanzen in der Proteinproduktion

• große Erfahrungen aus der traditionellen Pflanzenzüchtung
• Selbstbefruchtung
• Regenerationsfähigkeit
• billige Kultivierung und Lagerung
• beliebiges "Upscaling" durch Feldanbau
• frei von humanen Pathogenen (insbesondere Viren)

Schwächen von E.coli

• keine posttranslationalen Modifikationen
• Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur
• Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies")
• Freisetzung von Pyrogenen

Schwächen von Pflanzen bei der Proteinproduktion

  • Sekundäre Zellwand
  • Polyploidie
  • somaklonale Variation
  • geringe Produktmengen
  • falsche Glykosylierung
    • simple N-Glykane ohne Sialinsäure
    • ungewöhnliche Verknüpfungen, z.B. alpha 1-3-verknüpfte Fucose statt alpha 1-6- Verknüpfung und Xylose(beta 1-2)Mannose
  • "Gene silencing"
  • rekombinantes Protein ist im Cytosol in der Regel instabil
  • aufwändige Reinigung der Produkte
  • spezielle regulatorische Anforderungen an "Freisetzung" transgener Pflanzen
  • bei Feldanbau keine GMP-Bedingungen in der Produktion

Stärken von Säugerzellen in der Proteinproduktion

• sehr nahe am "humanen System"
• korrekte Faltung auch komplexer Proteine
• Sekretion in das Kulturmedium
• (fast) authentische posttranslationale Modifikationen

Prinzipielle Schwächen von Säugerzellen in der Proteinproduktion

• teure Medien
• langsames Wachstum
• hohe Investitionskosten für Fermentation
• hohe Produktionskosten
• hohe Lagerungskosten für Master-Zelllinien
• "Upscaling" ist schwierig
• möglicherweise anfällig für humane Pathogene (vor allem Viren)
• relativ geringe Proteinmengen produzierbar

  • fast alle Säuger (Hamster-, Maus-Zelllinien) besitzen das Enzym α1,3-Galactosyltransferase
    • daraus resultiert terminales Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc
    • Enzym fehlt in Menschen, Menschenaffen und Altwelt-Affen
    • darum ist Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc stark antigen
    • Gen für α1,3-Galactosyltransferase ist in CHO-Zelllinien inaktiviert

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