vom Gen zum rekombinanten Wirkstoff

• Oligo-Desoxythymidin-Primer an poly(A)-Ende -> poly(dT)-Stretch=Starter für reverse Transkription
• analog enzymatischer DNA-Synthese, nur mit sog. RNA-abhängiger DNA-Polymerase, auch Reverse Transkriptase (DNA-Polymerase, die RNA als Matrize akzeptiert)
• ->RNA/DNA-Hybrid
• enzymatischer Abbau RNA-Teil (RNAse H)
• Synthese vom zweiten DNA-Strang komplementär zum ersten (normale DNA-abhängige DNA-Polymerase)

• PCR mit für Zielgen spezifischen Primern (Isolation gewünschter cDNA aus Gesamt-cDNA)
• schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen (palindromisch-überhängende Enden)
• Kombination mit geeignetem Promotor (wirtspezifisch) -> Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterasebindung) = Ligation

• Amplifizierung rekombinierter Einzelmoleküle durch Bakterienzellen
• keine Signalsequenz für DNA-Replikation in zu replizierender DNA -> Platzierung in Plasmide
• Amplifizierung der Plasmide in Bakterienzellen

• repliziert Plasmide natürlicherweise
• nicht pathogen
• Genom komplett bekannt
• umfangreiche Erfahrung der Genetik
• nimmt leicht DNA auf
• schnelles Wachstum
• einfache Handhabung

• hohe Proteinausbeute
• authentisches Protein
  • naturidentische Aminosäuresequenz
  • korreke Tertiärstruktur
  • korrekte posttranslationale Modifikationen
• steuerbare Expression
• möglichst einfache Reinigung des Produktes
  • Sekretion in Kulturmedium
• Abwesenheit Pathogene
• Abwesenheit Pyrogene
• möglichst geringe Produktionskosten
  • kurze Fermentationszeiten
  • geringe Fermentationskosten
  • kostengünstige Medien
• Möglichkeit zum "upscaling" (vom Versuchs- zum Produktionsmaßstab)

• echter Eukaryont
• schnelles Wachstum
• umfangreiche Erfahrung mit Hefe-Genetik
• Genom vollständig bekannt
• Zellen und deren Produkte sind nicht pathogen
• Zellen produzieren keine Pyrogene
• meist korrekte Faltung der exprimierten Proteine
• zum Teil hohe Proteinausbeuten
• Sekretion in das Kulturmedium
• einige posttranslationale Modifikationen sind machbar
• biologisch sicher (genetically recognized as safe, GRAS)
• nimmt relativ leicht DNA auf
• einfache Handhabung
• kostengünstige Medien

• große Erfahrungen aus der traditionellen Pflanzenzüchtung
• Selbstbefruchtung
• Regenerationsfähigkeit
• billige Kultivierung und Lagerung
• beliebiges "Upscaling" durch Feldanbau
• frei von humanen Pathogenen (insbesondere Viren)

• keine posttranslationalen Modifikationen
• Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur
• Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies")
• Freisetzung von Pyrogenen

• Sekundäre Zellwand
• Polyploidie
• somaklonale Variation
• geringe Produktmengen
• falsche Glykosylierung
  • simple N-Glykane ohne Sialinsäure
  • ungewöhnliche Verknüpfungen, z.B. alpha 1-3-verknüpfte Fucose statt alpha 1-6- Verknüpfung und Xylose(beta 1-2)Mannose
• "Gene silencing"
• rekombinantes Protein ist im Cytosol in der Regel instabil
• aufwändige Reinigung der Produkte
• spezielle regulatorische Anforderungen an "Freisetzung" transgener Pflanzen
• bei Feldanbau keine GMP-Bedingungen in der Produktion

• sehr nahe am "humanen System"
• korrekte Faltung auch komplexer Proteine
• Sekretion in das Kulturmedium
• (fast) authentische posttranslationale Modifikationen

• teure Medien
• langsames Wachstum
• hohe Investitionskosten für Fermentation
• hohe Produktionskosten
• hohe Lagerungskosten für Master-Zelllinien
• "Upscaling" ist schwierig
• möglicherweise anfällig für humane Pathogene (vor allem Viren)
• relativ geringe Proteinmengen produzierbar

• fast alle Säuger (Hamster-, Maus-Zelllinien) besitzen das Enzym α1,3-Galactosyltransferase
  • daraus resultiert terminales Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc
  • Enzym fehlt in Menschen, Menschenaffen und Altwelt-Affen
  • darum ist Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc stark antigen
  • Gen für α1,3-Galactosyltransferase ist in CHO-Zelllinien inaktiviert