vom Gen zum rekombinanten Wirkstoff

Schritte, Vorteile und Nachteile von Expressionssystemen

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Fichier Détails

Cartes-fiches	12
Langue	Deutsch
Catégorie	Biologie
Niveau	Université
Crée / Actualisé	18.07.2016 / 20.07.2016
Lien de web	https://card2brain.ch/box/vom_gen_zum_rekombinanten_wirkstoff
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1. Transkription DNA -> mRNA durch RNA-Polmerasen

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gesamter RNA-Pool der Zelle zu der Zeit
Fixierung der mRNA aus Gesamt-RNA:
- eukaryontische mRNAs enden immer mit Polyadenin (poly(A))-Schwanz
- Hybridisierung des poly(A)-Endes an stationäres poly(T)
- anschließende Eluierung

2. reverse Transkription ("Umschreiben") der mRNA in copy-DNA (cDNA)

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Oligo-Desoxythymidin-Primer an poly(A)-Ende -> poly(dT)-Stretch=Starter für reverse Transkription
analog enzymatischer DNA-Synthese, nur mit sog. RNA-abhängiger DNA-Polymerase, auch Reverse Transkriptase (DNA-Polymerase, die RNA als Matrize akzeptiert)
->RNA/DNA-Hybrid
enzymatischer Abbau RNA-Teil (RNAse H)
Synthese vom zweiten DNA-Strang komplementär zum ersten (normale DNA-abhängige DNA-Polymerase)

3. Gen-spezifische PCR

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PCR mit für Zielgen spezifischen Primern (Isolation gewünschter cDNA aus Gesamt-cDNA)
schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen (palindromisch-überhängende Enden)
Kombination mit geeignetem Promotor (wirtspezifisch) -> Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterasebindung) = Ligation

4. Amplifizieren ("Vervielfältigung") von rekombinierten DNA-Molekülen

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Amplifizierung rekombinierter Einzelmoleküle durch Bakterienzellen
keine Signalsequenz für DNA-Replikation in zu replizierender DNA -> Platzierung in Plasmide
Amplifizierung der Plasmide in Bakterienzellen

Vorteile E.coli als "Klonier-Bakterium"

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repliziert Plasmide natürlicherweise
nicht pathogen
Genom komplett bekannt
umfangreiche Erfahrung der Genetik
nimmt leicht DNA auf
schnelles Wachstum
einfache Handhabung

Anforderungen an industriell nutzbares Expressionssystem

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hohe Proteinausbeute
authentisches Protein
- naturidentische Aminosäuresequenz
- korreke Tertiärstruktur
- korrekte posttranslationale Modifikationen
steuerbare Expression
möglichst einfache Reinigung des Produktes
- Sekretion in Kulturmedium
Abwesenheit Pathogene
Abwesenheit Pyrogene
möglichst geringe Produktionskosten
- kurze Fermentationszeiten
- geringe Fermentationskosten
- kostengünstige Medien
Möglichkeit zum "upscaling" (vom Versuchs- zum Produktionsmaßstab)

Vorteile von Hefen für die Proteinproduktion (Saccharomyces cerevisiae - Bäckerhefe)

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echter Eukaryont
schnelles Wachstum
umfangreiche Erfahrung mit Hefe-Genetik
Genom vollständig bekannt
Zellen und deren Produkte sind nicht pathogen
Zellen produzieren keine Pyrogene
meist korrekte Faltung der exprimierten Proteine
zum Teil hohe Proteinausbeuten
Sekretion in das Kulturmedium
einige posttranslationale Modifikationen sind machbar
biologisch sicher (genetically recognized as safe, GRAS)
nimmt relativ leicht DNA auf
einfache Handhabung
kostengünstige Medien

Stärken von Pflanzen in der Proteinproduktion

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• große Erfahrungen aus der traditionellen Pflanzenzüchtung
• Selbstbefruchtung
• Regenerationsfähigkeit
• billige Kultivierung und Lagerung
• beliebiges "Upscaling" durch Feldanbau
• frei von humanen Pathogenen (insbesondere Viren)

Schwächen von E.coli

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• keine posttranslationalen Modifikationen
• Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur
• Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies")
• Freisetzung von Pyrogenen

Schwächen von Pflanzen bei der Proteinproduktion

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Sekundäre Zellwand
Polyploidie
somaklonale Variation
geringe Produktmengen
falsche Glykosylierung
- simple N-Glykane ohne Sialinsäure
- ungewöhnliche Verknüpfungen, z.B. alpha 1-3-verknüpfte Fucose statt alpha 1-6- Verknüpfung und Xylose(beta 1-2)Mannose
"Gene silencing"
rekombinantes Protein ist im Cytosol in der Regel instabil
aufwändige Reinigung der Produkte
spezielle regulatorische Anforderungen an "Freisetzung" transgener Pflanzen
bei Feldanbau keine GMP-Bedingungen in der Produktion

Stärken von Säugerzellen in der Proteinproduktion

• sehr nahe am "humanen System"
• korrekte Faltung auch komplexer Proteine
• Sekretion in das Kulturmedium
• (fast) authentische posttranslationale Modifikationen

Prinzipielle Schwächen von Säugerzellen in der Proteinproduktion

• teure Medien
• langsames Wachstum
• hohe Investitionskosten für Fermentation
• hohe Produktionskosten
• hohe Lagerungskosten für Master-Zelllinien
• "Upscaling" ist schwierig
• möglicherweise anfällig für humane Pathogene (vor allem Viren)
• relativ geringe Proteinmengen produzierbar

fast alle Säuger (Hamster-, Maus-Zelllinien) besitzen das Enzym α1,3-Galactosyltransferase
- daraus resultiert terminales Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc
- Enzym fehlt in Menschen, Menschenaffen und Altwelt-Affen
- darum ist Gal(α1,3)Gal(β1,4)GlcNAc stark antigen
- Gen für α1,3-Galactosyltransferase ist in CHO-Zelllinien inaktiviert

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