vom Gen zum rekombinanten Wirkstoff
Schritte, Vorteile und Nachteile von Expressionssystemen
Schritte, Vorteile und Nachteile von Expressionssystemen
Kartei Details
| Karten | 12 |
|---|---|
| Sprache | Deutsch |
| Kategorie | Biologie |
| Stufe | Universität |
| Erstellt / Aktualisiert | 18.07.2016 / 20.07.2016 |
| Lizenzierung | Keine Angabe |
| Weblink |
https://card2brain.ch/box/vom_gen_zum_rekombinanten_wirkstoff
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1. Transkription DNA -> mRNA durch RNA-Polmerasen
- gesamter RNA-Pool der Zelle zu der Zeit
- Fixierung der mRNA aus Gesamt-RNA:
- eukaryontische mRNAs enden immer mit Polyadenin (poly(A))-Schwanz
- Hybridisierung des poly(A)-Endes an stationäres poly(T)
- anschließende Eluierung
2. reverse Transkription ("Umschreiben") der mRNA in copy-DNA (cDNA)
- Oligo-Desoxythymidin-Primer an poly(A)-Ende -> poly(dT)-Stretch=Starter für reverse Transkription
- analog enzymatischer DNA-Synthese, nur mit sog. RNA-abhängiger DNA-Polymerase, auch Reverse Transkriptase (DNA-Polymerase, die RNA als Matrize akzeptiert)
- ->RNA/DNA-Hybrid
- enzymatischer Abbau RNA-Teil (RNAse H)
- Synthese vom zweiten DNA-Strang komplementär zum ersten (normale DNA-abhängige DNA-Polymerase)
3. Gen-spezifische PCR
- PCR mit für Zielgen spezifischen Primern (Isolation gewünschter cDNA aus Gesamt-cDNA)
- schneiden von cDNA an spezifischen Stellen mit Restriktionsendonukleasen (palindromisch-überhängende Enden)
- Kombination mit geeignetem Promotor (wirtspezifisch) -> Zusammenfügen zweier DNA-Fragmente (schließen einer Phosphodiesterasebindung) = Ligation
4. Amplifizieren ("Vervielfältigung") von rekombinierten DNA-Molekülen
- Amplifizierung rekombinierter Einzelmoleküle durch Bakterienzellen
- keine Signalsequenz für DNA-Replikation in zu replizierender DNA -> Platzierung in Plasmide
- Amplifizierung der Plasmide in Bakterienzellen
Vorteile E.coli als "Klonier-Bakterium"
- repliziert Plasmide natürlicherweise
- nicht pathogen
- Genom komplett bekannt
- umfangreiche Erfahrung der Genetik
- nimmt leicht DNA auf
- schnelles Wachstum
- einfache Handhabung
Anforderungen an industriell nutzbares Expressionssystem
- hohe Proteinausbeute
- authentisches Protein
- naturidentische Aminosäuresequenz
- korreke Tertiärstruktur
- korrekte posttranslationale Modifikationen
- steuerbare Expression
- möglichst einfache Reinigung des Produktes
- Sekretion in Kulturmedium
- Abwesenheit Pathogene
- Abwesenheit Pyrogene
- möglichst geringe Produktionskosten
- kurze Fermentationszeiten
- geringe Fermentationskosten
- kostengünstige Medien
- Möglichkeit zum "upscaling" (vom Versuchs- zum Produktionsmaßstab)
Vorteile von Hefen für die Proteinproduktion (Saccharomyces cerevisiae - Bäckerhefe)
- echter Eukaryont
- schnelles Wachstum
- umfangreiche Erfahrung mit Hefe-Genetik
- Genom vollständig bekannt
- Zellen und deren Produkte sind nicht pathogen
- Zellen produzieren keine Pyrogene
- meist korrekte Faltung der exprimierten Proteine
- zum Teil hohe Proteinausbeuten
- Sekretion in das Kulturmedium
- einige posttranslationale Modifikationen sind machbar
- biologisch sicher (genetically recognized as safe, GRAS)
- nimmt relativ leicht DNA auf
- einfache Handhabung
- kostengünstige Medien
Stärken von Pflanzen in der Proteinproduktion
• große Erfahrungen aus der traditionellen Pflanzenzüchtung
• Selbstbefruchtung
• Regenerationsfähigkeit
• billige Kultivierung und Lagerung
• beliebiges "Upscaling" durch Feldanbau
• frei von humanen Pathogenen (insbesondere Viren)
