Vocabulary Microbiology

Okular x Objektiv = Endvergrösserung (x-fach)

10x x 100x = 1000-fach

Objektiv und Tubuslinse erzeugen reeles vergössertes Bild – durch Okular vergrössert zu virtuellem Bild.

Bei Verwendung einer Kamera anstatt Okular wird das Bild direkt auf den Kamerasensor ohne Nachvergrösserung projiziert.

Objektive sind das komplexeste Stück im gesamten optischen Strahlengang. Bis zu 15 oder mehr hintereinander gereihte Linsenelemente oder Gruppierungen befinden sich in einem Objektiv. Die Linsen gleichen die Fehler aus, da keine Linse perfekt ist.

Die Linsenkorrektur wird nötig da verschiedene Farbspektren werden durch die unterschiedlichen Wellenlängen an der Linse unterschiedlich gebrochen. Blau hat eine kurze Wellenlänge und wird stärker gebrochen als rotes Licht --> Chromatische Aberration (chroma – Farbe; Abberare – abschweifen). Sammellinse: bündeln der Farbanteile von weissem Licht nicht in einem einzigen Fokus.

Blau und Rot in einem Fokus.

Sichtbares Spektrum mit identischem Fokus. Enorm wichtig für die Fluoreszenzmikroskopie.

Plankorrekturen werden nötig durch Abbildungsfehler wobei in Randzonen durch Bildwölbung eine Unschärfe entsteht. Durch den Einbau von zusätzlichen Linsen wird die Bildwölbung korrigiert --> Plankorrektur (Plan). Beste Linsen daher mit Bezeichnung Plan-Apo.

Definition des Auflösungsvermögens eines Objektivs und der Lichtstärke.

Anders ausgedrückt: Das Vermögen eines optischen Elements Licht zu Fokussieren.

Je höher der Wert der NA:

• Desto höher die Auflösung.
• Umso mehr Licht kann für die Anregung der Fluoreszenz verwendet werden.
• Umso geringer der Schärfentiefe (Ausdehnung des scharf fokussierten Bereichs).
• Umso geringer meist der Arbeitsabstand.

NA charakterisiert durch:

NA= n x sinα

Lichtbrechungskoeffizient (n) des Mediums zwischen Objektiv und Präparat (Luft, n=1).

und dem Sinus (sin) des halben Öffnungswinkels (α) des Objektivs zur optischen Achse (sinα).

In Luft -> NA<1, max 0.95 (1xsin73°).

Die numerische Apertur wird vergrössert durch einen grösseren Öffnungswinkel des Objektivs (sinα) oder durch einen höheren Brechhungsindex des (Immersions-) Mediums. Lichtbrechungskoeffizient des Mediums (n) mit Brechungsindex muss grösser als eins sein.

Wasser n=1.33 -> NA 1.2

Glycerin n=1.47

Öl n=1.51 -> NA 1.4

Kleinster Abstand zwischen zwei Objektstrukturen, bei dem diese noch getrennt wahrgenommen werden können.

Abbe Limit: Ein Lichtmikroskop kann keine Strukturen abbilden, die näher zusammenliegen als die halbe Wellenlänge des verwendeten Lichts.

Full Width at Half Maximum. Zur experimentellen Bestimmung der Auflösung eines Mikroskops.

Bei einem Goldbead wird zuerst das Fluoreszenzmaximum und dann der Durchmesser des Beads bei halbem Fluoreszenzmaximum bestimmt. FWHM ist je nach Wellenlänge grösser oder kleiner. Je höher die Wellenlängen desto kleiner die Auflösung.

Maximum der 2. Airy-Disk im ersten Minimum der 1. Airy-Disk. Hier Intensität um 20-30% reduziert – Ausreichen um zwei Punkte voneinander zu unterscheiden.

Die Auflösung ist durch das Abbe-Limit formuliert und unterliegt dem Rayleigh Kriterion.

• Abhängig von (i) der Wellenlänge (je kleiner, desto höher die Auflösung), (ii) der NA (Auflösungsvermögen des Objektivs).
• Erklärbar durch die PSF des optischen Systems (Verzerrung und Wellennatur des Lichts) und der Airy Disk (hohe NA, dünne Airy Disk -> zwei Punkte besser trennbar).
• Aus der PSF kann die Auflösungskapazität des optischen Systems bestimmt werden.

Rechenbeispiel:

Trockenobjektiv mit NA 0.25 (bei vielen 10x-Objektiven), gelb-grünes Licht mit 550 nm.

d=Lambda/2*NA

d=550/(2*0.25)=1100nm

Ölimmersionsobjektiv mit NA 1.4 (bei vielen 100x-Objektiven), Licht mit 550nm.

d=550/2*1.4= 196nm

Das zweite Objektiv kann besser auflösen.

Spezielle lichtmikroskopische Technik unter Verwendung von Fluoreszenz. Spezifische Information über Lokalisation einzelner fluoreszierender Moleküle, die als einzelne Lichtquelle zu verstehen sind.

Fluorochrome / Fluorophore, senden Licht aus, wenn sie mit einer definierten Wellenlänge bestrahlt werden. 

Stokes -> Fluoreszenz

Jablonski -> physikalische Prozesse der Fluoreszenz

Lichtquelle in einer Probe enthalten: Fluorochrom/ Fluorophor.

1. Fluorochrom-Atome nehmen Energie von Photonen auf -> angeregter Zustand (Anregung).

2. Rückkehr in energieärmeren Zustand – Energieverlust = Lichtemission.

Fluoreszenz: Emission etwa so lange wie Anregung.

Phosphoreszenz: Emission länger als Anregung (Leuchtsterne).

Beides Ist Lumineszenz

Energieärmeres Photon der Emission bedeutet kleinere Energie und damit grössere Wellenlänge (Ausnahme Zweiphotoneneffekt).

Je grösser der Stokes Shift, desto einfacher kann Anregung von Emission getrennt werden. Shift ist der Abstand der Wellenlängen-Peaks der Absorption (Exitation) und Fluoreszenz Emission. Dazwischen befindet sich meist ein Spectral Overlap.

Org. Materialien oder Farbstoffe -> Rhodamine, Pyronine, konjug. Bindungen (Teilen der Elektronen).

Fluoreszierende Proteine -> GFP meist transiente (vorübergehende) Expression, YFP, RFP, CFP, mNeptune, mCardinal, mPlum…

GFP ist ein grün fluoreszierendes Protein mit dem Fluorophor / Chromophore aus Serin, Tyrosin, Glycin und einer beta-barrel Struktur als Schutz aus 11 alpha Helices & Loops. Durch Mutation im Chromophore S65T erhält man eGFP (e=enhanced) als bessere Version des GFP. eGFP leuchtet doppelt so hell wie die WT-Form. Es kann mit tieferer Wellenlänge angeregt werde und verbraucht somit eine tiefere Anregungsenergie und führt zu reduziertem Photodamage.

Durch Punktmutationen kann GFP weiterentwickelt werden und es können Varianten mit abweichenden Absorptions- und Emissionsspektren gewonnen werden.

Limitierender Faktor für gute Aufnahmen (Signal-Hintergrund-Verhältnis). Anregung mit meist kurzwelligem Licht, geringer bei längeren Wellenlängen. Abhängig von Zell-, Gewebetyp und physiologischem Status. Chlorophyll in Pflanzen, NADH/NADPH, Flavine und Flavoproteine in Säugetierzellen, Kollagen und Elastin in Bindegewebe.

Live-Cell: Bestandteile von Kulturmedium, z.B. Riboflavin, Phenolrot (pH-Indikator) Imaging mit anderen Medien - HBSS, Phenol Rot-frei

Freie Aldehydgruppen von PFA/GA-Fixierung.

Quenching: bsp. freie Aldehydgruppen besetzen und Autofluoreszenz vermeiden

Anregungslicht: Hochdruckmetalldampflampe (Xenon/Quecksilber), LEDs

A) Anregungsfilter: Selektion der Wellenlänge (passend zum Fluorochrom), im Fluoreszenzwürfel/ Filterrad.

B) Dichroitischer Teilerspielegel 45°, undurchlässig für Anregungslicht, durchlässig für längerwelliges Emissions-/ Fluoreszenzlicht

C) Emissionsfilter: weitere Einengung des Fluoreszenzlichts für spezifisches Signal.

Absorptionsfilter: weniger spezifisch

Interferenzfilter: Spiegelung (keine Absorption / Wärmeaufnahme)

Bandpassfilter: Licht eines gewissen Wellenlängenbereichs kann passieren

Langpassfilter: Licht bestimmter Wellenlänge kann passieren

Weitfeldmikroskopie mit Fluoreszenzdetektion nicht nur aus der Fokusebene. Ober und unterhalb des Fokus wird die Fluoreszenz ebenfalls angeregt und führt zu unscharfen Markierungen des eigentlich scharfen Bereichs. Durch die Überlagerung wird die Bildqualität beeinflusst. Fehlender Kontrast und schlechtere Auflösung führen zum Detailverlust. Die Lösung bietet die konfokale Mikroskopie.

Durch die Verwendung von Lochblenden (pinhole) in der Feldblendenebene nach dem Anregungslicht wird das Licht ausserhalb des Fokus abgeschwächt. Vor dem Detektor werden die Signale ausserhalb der Fokusebene ausgeblendet. der Punkt in der Mitte der Lochblende und der Beleuchtungspunkt im Präparat sind dabei gleichzeitig im Fokus. Die Grösse des Pinholes wird in Airy-Einheiten angegeben - 1 AU die grösse des Pinholes hat einen entscheidenden Einfluss auf das Auflösungsvermögen.

Unterschied zur Fluoreszenzmikroskopie ist dass die Fluorochrome durch Verwendung von Lasern unterschiedlicher Wellenlängen angeregt werden. Im Laser (light amplification by stimulated emission of radiation) werden viele Atome in den angeregten Zustand versetzt (metastabiler angeregter S1-Zustand). Die stimulierte Emission wird durch ein definiertes Photon mit bestimmter, höherer Wellenlänge ausgelöst. Die emittierten Photonen haben die gleiche Wellenlänge, Energie und Bewegungsrichtung, wie das einfallende Photon - sie sind eine Kopie de einfallenden Photons. Die Photonen werden von Spiegeln reflektiert und durch die Reflektion amplifiziert/ vervielfältigt → Kettenreaktion. Monochromatisches (einfarbiges), kohärentes (phasengleiches Elementarwellen mit gleicher Frequenz), stark fokussierbares Licht( Argon-, Dioden-, Titanium-Saphir-Laser).  Das Laserlicht wird in das Präparat fokussiert und mittels punktförmigen Sannen wird die gesamte Probe Pixel für Pixel abgetastet. Das konfokale Bild wird dann Punkt für Punkt zusammengesetzt. Es ist zu keinem Zeitpunkt ein vollständiges Bild vorhanden.

Die optische Schichtdicke: z-Auflösung wird durch

• die Wellenlänge
• die Numerische Apertur des Objektivs
• den Blendendurchmesser (Pinhole)
  • die Detektionslochblende erlaubt Änderungen der Konfokalität - voll geöffnet, keine konfokale Aufnahme.

Punkt für Punkt linienweise Scannen mit fokussiertem Laserstrahl

• directional
• bi-directional
  • Line/Frame accumulation - aufsummieren des Signals
  • Line/Frame Average - Mittelung des Signals
    • Problem: Zickzack-Linien wenn Mik. schlecht eingestellt. unidirectional ist sicherer dauert aber länger.
  • Galvo-Galvo-Scan: Bewegung zwei 1D-Spiegel im Strahlengang in X und Y Achse
  • Resonant Scan noch schneller

Keine Kamera da zu keinem Zeitpunkt ein vollständiges Bild. Es werden elektronische Detektoren verwendet. Photosensitive Oberflächen detektieren die einfallenden Photonen und generieren elektronische Spannungen. Die Lichtenergie wird in elektrische Energie umgewandelt und dieses Signal kann verstärkt werden.

PMT - photomultiplier tube: Sekundärer Elektronenvervielfacher zwischen Photokathode und Anode liegen Dynoden. Vervielfälltigung der Elektronen hilft einen geringen Lichtstrom zu einem grossen elektrischen Stromzu vervielfältigen.

APD - avalanche photodiode

Ein Filtersystem neben den Filterwürfeln, das electro-optisch funktioniert. Es moduliert die Wellenlänge und Amplitude mittels periodischem Ändern des Brechungsindexes des Kristalls durch Kopplung akustischer und optischer Wellen. Es entsteht ein Brechungsgitter im Kristall wobei Licht bestimmter Wellenlänge abgelenkt wird und in Mikrosekunden schaltet.

200MHz = 528 nm

300 MHz = 412 nm

AOBS zum spektralen Filtern, ähnlich dichroiden Filtern. GFP und YFP sind simultan aufnehmbar, was mit Filtern unmöglich ist. AOBS ist viel schneller als ein mechanischer Filter

Durch axiale serielle z-Schnitte (0.5-1.5 µm)

Die Bildserie wird durch koordinierte schrittweise Veränderung des Fokus (z-Schnitte) und sequentieller Bildaufnahme in xy  zusammengefügt , wodurch ein 3D Bilderstapel aus verschiedenen optischen Schnitten entsteht.

Das digitale Bild und die Auflösung entstehen durch das Sampling Intervall (Zahl der Abtastpunkte pro aufzulösende Struktur). Nach dem Nyquist Kriterium sollte das Sampling Intervall etwa 2.3 mal höher sein als die höchste räumliche Frequenz im Bild, um keine räumliche Information zu verlieren.

Ist das Sampling intervall grösser als das Niquist Limit geht kommt es zum Undersampling und Info geht verloren.

Ist das Sampling Intervall kleiner als das Nyquist Limit kommt es zum Oversampling. Man erhält eine grössere Zahl an Messwerten ohne zusätzlichen Informationsgewinn (Fotobleichen).

Nyquist Theorem/ Kriterium

• Abbe's optische Auflösungsgrenze: ~220 nm
• Sampling Interval müsste daher ~110 nm betragen
  • Bei 512 Pixel/ Linie = maximal horizontales Bildfeld von 56 µm (512 x 110 nm)
• zuviele Pixel geben keine weitere Informationen
  • können jedoch zur Präzision/ Genauigkeit einzelner Features im Bild beitragen.
  • Hochaufgelöste Bilder sollten 2.5-3x Sampling Interval für die kleinsten Feautres aufweisen.
• Rauschen
  • geringe Lichtleistung der Probe - Fluoreszenzdetektion
  • Detektorrauschen (Dunkelrauschen, Sekundäremissionsrauschen), Laserrausche, Schrotrauschen des Lichts
    • statische Natur (keine Rauschperiodizität)
  • Verschlechtert die Auflösung, schlechter Kontrast
  • Signal-zu-Rausch Verhältnis (SNR, signal to noise ratio
    • Signal hoch + Rauschen tief = guter Kontrast

Verlängerung der Pixelzeit: bei jedem Pixel werden zusätzliche Photonen gesammelt. Belastung der Probe durch mögliche Bleicheffekte oder Sättigungserscheinungen der Fluorophore.

Oder Einsatz der Average Funktion (Signalmittelung): Jede Zelle des Bildes/ gesamtes Bild, wird mehrmals abgetastet. Die Intensitätswerte/ Pixel werden aufsummiert oder gemittelt (geringe Belastung der Probe - Pixelzeit konstant).

Das SNR Verhältnis wird um den Faktor 2 verbessert. Die höhere Anzahl detektierter Photonen verringert den Enfluss des Schrottrauschens auf die Bildqualität. Beide Methoden verringern ebenfalls Detektorrausch und Laserrauschen (bei hohen Singalstärken).

Bei der Anfärbung mehrerer Proteine zur Untersuchung deren Wechselwirkung und räumlicher Verteilung zueinander tritt das Problem des Cross-talk auf. Heisst zwei Fluorophore überlappen sich teilweise. Der Spektrale overlap von einem Fluorophor beim anderen wird detektiert und führt zu falschen Signalen. Mittels trenne der beiden Aufnahmen und sequentiellen Bildaufnahmen mit definierten Detektionsbereichen werden die overlaps voneinander getrennt.

Der Pearson Korrelationskoeffizient dient der Bestimmung der Korrelation zweier Proteine. 1.0= beide Proteine sind gleichzeitig vorhanden. 100% Co-Lokalisation kann durch eine positiv Kontrolle bestimmt werden indem an einem AK zwei verschiedene Fluorophore angehängt werden.

HaloTag: modifiziertes Haloalkan Dehalogenase bindet an Protein von Interesse. Kovalentes, irreversibles Binden von synthetischen HaloTag-Liganden. Die Bindung ist hochspezifisch und schnell. Chloralkan-Linker an z.B. synthetischem Farbstoff zum Binden an Protein HaloTag.

TMR: Tetramethyl-Rhodamine ist ein membrangängiger Farbstoff der das intrazelluläre Markieren von HaloTag Proteinen ermöglicht. Die Expression des HaloTag Proteins ist nötig.

Die Multiphotonenmikroskopie ermöglicht das tiefere Mikroskopieren von Geweben. Bei der 2-Photonen Mikroskopie werden zur Anregung des Fluorophors 2 Photonen gleichzeitig durch deren Summierung der Energien absorbiert werden. Die Energie eines Photons ist invers proportional zur Wellenlänge. Die zwei Photonen müssen die doppelte Wellenlänge wie das für die einfache Anregung besitzen. Beide Photonen müssen innerhalb 10^-18 Sekunden (eine Attosekunde) aufeinandertreffen.

Die Anregung durch multiple Photonen geschieht nur am Fokuspunkt. Das Pinhole ist dann prinzipiell nicht nötig. Photonen höherer Wellenlänge - IR minimieren das Photobleichen und die Phototoxizität (gut bei lebenden Zellen). IR Anregung erlaubt tieferes Eindringen in dicke Proben in vivo. Reduktion der Lichtbrechung verglichen zu kürzeren Wellenlängen. Ermöglicht Bildgebung von dicken lebenden Gewebeproben (Hirnschnitte und Embryonen).

Zwei Photonen mit tiefer Wellenlänge haben in der Summe eine höhere Wellenlänge des Lichtes. Höhere Wellenlänge = tiefere Eindringtiefe. Die Anregung geschieht dann nur im Fokuspunkt.