Vocabulary Microbiology

FRAP steht für Fluorescence recovery after photobleaching und wird meist mit GFP oder anderen FPs verwendet um die Mobilität (Diffusion, aktiver Transport, usw) von Stoffen in der Zelle zu messen. Bei FRAP werden in einem kleinen selektierten Bereich in der Zelle Fluorophore photogebleicht. Eine intesive Laser-Illumination bleicht einen kleinen Bereich mit hohem konfokalen Laser-scanning (Variation der Laserintensität durch den AOTF). Danach wir die Rate und der Umfang der Fluoreszenzrückkehr (recovery) in diesem Bereich aufgezeichnet (mit geringer Laserpower).  Dies gibt dann Informationen zur Repopulation durch Fluoreszenz und der kinetischen recovery.

Fluorophor werden weggebleicht. Dann wird beobachtet ob wieder Fluorophore in diesem Bereich auftreten. Dieses wiederauftreten der Fluorophore beweisen mobilität der Proteine. Wird aber nicht 100% der Kurve erreicht ist dies ein Hinweis, dass sich auch Proteine darunter befinden, die sich nicht bewegen.

Der durchschnittliche Intensitätsverlust (Bleichen) muss mittels Kontrollspots miteinberechnet werden: normalisierung der FRAP Kurve.

Ein FRAP experiment würde theoretisch auch ohne Laser funktionieren, würde aber ewig dauern.

Es gibt das einmalige Photobleaching, das vielfache Photobleaching und die Photoaktivierung um Mobilität zu bestimmen (Photoactivation, Photoconversion, Photoswitching).

Fluorescence/ Förster resonance energy transfer (FRET) erlaubt die Quantitativ-Zeitliche und räumliche Information über die Bindung und Interaktion von Proteinen, Lipiden, Enzymen und Nukleinsäuren in lebenden Zellen zu. Interaktionsnachweis wird durch den Energietransfer von einem Donor-Fluorophor auf ein Akzeptator-Fluorophor.

• Vorteil der Schnelligkeit von Spinning Disk Mikroskopen.

Die Vorraussetzung von FRET sind

• überlappende Fluoreszenzspektren der Fluorophore
• Mehr Acceptor- als Donor-Moleküle
• Donor und Akzeptor müssen korrekt am Protein getagged sein (C- oder N-Termini)
• Photobleaching gefährdet die Auswertung

Vor dem Bleichen FRET zwichen CFP-YFP

• Fluoreszenzintensität: Donor tief, Akzeptor hoch
• Fluoreszenzlebenszeit: Donor tief

Nach dem Bleichen: Kein FRET zwischen CFP-YFP

• Fluoreszenzintensität: Donor hoch, Akzeptor nicht mehr vorhanden
• Fluoreszenzlebenszeit: Donor hoch

FCS zur Detektion von molekularen Dynamiken in Volumina mit nur wenigen Molekülen. Dient der Bestimmung von chemischen Reaktionsraten, Diffusionskoeffizienten, Molekulargewicht, Flow-raten und Aggregationen.

Kleiner Bereich mit fokussiertem Laser beleuchtet (non-scanning). Aufzeichnung von Fluktuationen spontaner Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von der Zeit. Stammen von dynamisch fluoreszierenden Molekülen. Kleine Moleküle diffundieren schnell durch illuminiertes Volumen und generieren kurze zufällige Intensitätspeaks. Grosse Komplexe produzieren lang-anhaltende, zeitabhängige Fluoreszenzmuster. Gemessen wird die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit F(t).

Vergrössert Abbildungen durchstrahlter Objekte nicht durch Lichtwellen sondern durch hochbeschleunigte Elektronenstrahlen (Kathodenstrahlen). Magnetische Felder lassen sich als Linse zum Fokussieren von Elektronen verwenden. Die Elektronen werden am Objektstrukturen gebeugt (nur im Hochvakuum). Enerieinhalt (Energie) bzw. Wellenlänbe  (Lambda) von angelegter Hochspannung abhängig. 

Auflösevermögen unterliegt den Prinzipien der Optik \(\lambda=h / (m*v)\)

h = Planksche Konstante, m = Teilchenmasse, v= Geschwindigkeit des Elektrons

Auflösungsvermögen im Bereich von 0.004 nm (optische Mikroskopie 200 nm)

Elektronenstrahlen durchdringen nur dünne Schichten (70-100nm). Die Streuung der Elektronen erzeut ein Schattenbild der lokal unterschiedlichen Elektronendichten und wird vergrössert dargestellt.

Monochromatische (einfarbige) Strahlung im Elektronenmikroskop erlaubt nur einfarbige Hell-Dunkel-Abbildung.

• Begrenzte Objektdicke (geringer als Durchmesser einer Bakterienzelle)
• Einbringen des Präparates in ein Vakuum
• Elektronenstrahl erhitzt Probe
  • Leichtflüchtige Elemente aus organischem Material (H, O, N) werden ionisiert und verdampfen.
    • Abbildung eines Lebensnahen Modells der ursprünglichen Struktur
• Bausteine organischer Substanzen (C, O, H, S, P) wenig elektronendicht (elektronenoptisch durchsichtig)
  • Bildkontrast durch Analgerung von Schwermetallen (Mo, Os, Pb, U)
    • DNA, Membranen

Transmissionselektronenmikroskop

Aflösung limitiert auf 2 nm (20 Angström) hervorgerufen durch Probleme mit der Probenpräparation, dem kontrast und Stahrlungsschäden.

Biologiesch Objekte maximal 10-100 nm Dicke. Mehrere Schritte bis zur endgültigen Probe nötig.

• Fixierung
• Dehydratisierung
• Einbettung
• Sektionierung
• Kontrastierung

Rasterelektronenmikroskop. Elektronen werden nicht durch Präparat geschossen.

Kryo-Fixierung unter hohem Druck

drastische Verringerung der Eiskristallbildung, hoher Druck verhindert Ausdehnung des Wassers.

Angelehnt an Laser-Scanning-Mikroskopie. Grösse der Lochblende (Pinhole) entspricht dem Fokusdurchmesser

1 Airy Einheit (AU)

Pinhole kann sehr klein gemacht werden: 0.2 AU - Auflösungsverbesserung auf 180 nm (Faktor 1.4) jedoch Verlust von 95% des Fluoreszenzsignals (das out -of-Fokus Licht).

Airyscan mit neuem Detektor Design arbeitet durch Anordnung vieler kleiner Detektoren, die in einer Lochblende von 0.2 AU entsprechen (kein Verlust des Fluoreszenzsignals). Durch das Pinhole wir eine Erhöhung des Signalauflösung gewonnen auf ca. 120 nm.

Bei der Nanoskopie wird das Abbe-Limit ( \(d= \lambda/ (2n*sin\alpha)\) )umgangen mittels der STED-Technologie bei der Fluorophore ausgeschalten werden und Moleküle die näher als 250 nm (<200 nm) getrennt detektiert werden können.

Stimulated emission depletion: mit einem zweiten Laser in Donut-Form werden Fluorophore ausgeschaltet.

Strukturen mit kleinerem Abstand als 20nm können detektiert werden.

Langsam kommt man in den Bereich dr AK-Sandwich Grösse, was heisst dass die Labels kleiner werden müssen.

GFP 4nm

HaloTag 5nm

Organischer Farbstof 1nm

IgG-Komplex 20nm

Ground state depletion microscopy followed by individual molecul return

Tripletzustand wird ausgenutzt, wobei Fluorophor in einen Dunkelzustand übergeht.

STochastic Optical Reconstruction Microscopy

PhotoActivated Localization Microscopy

Anregung von Fluorophoren durch Licht bestimmter Wellenlänge und Intensität (sehr gering, kein Laser). Durch die schwache Anregung Leuchten nur vereinzelt Fluorophore auf. Diese Koordinaten der Fluorophore werden nach und nach aufgenommen. Punkt um Punkt.  Detektion einzelner Fluoreszenzevents durch schnele sensitive Kamera (CCD Kamera).

REversible Saturable Optical Fluorescence Transition

Point spread function

Begrenzte Fähigkeit eines optischen Systems eine punktförmige Lichtquelle darzustellen – PSF ist das 3D-Abbild des Beugungsmusters eines punktförmigen Objekts (also der Airy Disk) – Verzerrung durch Systemeinstellung, Wellenlänge, Objektiv und dessen numerischer Apertur (NA), Brechzahl des (Immersions-) Mediums.

Die Wellenlänge des verwendeten Lichts und die NA des Objektivs limitieren die maximal erreichbare Auflösung. Objekte die Näher als 200nm beieinander liegen (blaues Licht) können nicht voneinander getrennt dargestellt werden.

Auflösung: d

Wellenlängen: λ (lambda)

Brechungsindex des Mediums: n

Öffnungswinkel des Objektivs: α

\(d= \lambda/(2n*sin\alpha)\)

\(NA= n*sin\alpha\)

Die Auflösung ist aufgrund der Beugung des Lichts begrenzt (Rayleigh-Kriterium) und der Verzerrung durch das optische Licht. Beugungsbegrenzt korrigiertes optisches System kann ein exakt punktförmiges Objekt nicht als Punkt abbilden. Mikroskopische Bilder leuchtender Punkte sind keine Punkte sondern Beugungsscheiben/ringe (Airy-Disk – Beugung des Lichts) mit zentralem Maximum ungeben von Ringen abnehmender Lichtintensität – deren Helligkeitsverteilung von der Punktspreizfunktion abhängt (point spread function: PSF).

• Tubus mit Okularen
• Objektive
• Objekttisch
• Kondensor
• Kollektorlinse
• Lichtquelle

Objektive oberhalb des Objekttisches.

Objektiv und Kondensor liegen beide nah am Präparat --> hohe Auflösung und Bildqualität.

Objektive unterhalb des Objekttisches. Durchlichtbeleuchtung daher oberhalb des Tisches.

Häufigste Wahl, aufgrund hoher Bedienerfreundlichkeit.

Okular x Objektiv = Endvergrösserung (x-fach)

10x x 100x = 1000-fach

Objektiv und Tubuslinse erzeugen reeles vergössertes Bild – durch Okular vergrössert zu virtuellem Bild.

Bei Verwendung einer Kamera anstatt Okular wird das Bild direkt auf den Kamerasensor ohne Nachvergrösserung projiziert.

Objektive sind das komplexeste Stück im gesamten optischen Strahlengang. Bis zu 15 oder mehr hintereinander gereihte Linsenelemente oder Gruppierungen befinden sich in einem Objektiv. Die Linsen gleichen die Fehler aus, da keine Linse perfekt ist.

Die Linsenkorrektur wird nötig da verschiedene Farbspektren werden durch die unterschiedlichen Wellenlängen an der Linse unterschiedlich gebrochen. Blau hat eine kurze Wellenlänge und wird stärker gebrochen als rotes Licht --> Chromatische Aberration (chroma – Farbe; Abberare – abschweifen). Sammellinse: bündeln der Farbanteile von weissem Licht nicht in einem einzigen Fokus.

Blau und Rot in einem Fokus.

Sichtbares Spektrum mit identischem Fokus. Enorm wichtig für die Fluoreszenzmikroskopie.

Plankorrekturen werden nötig durch Abbildungsfehler wobei in Randzonen durch Bildwölbung eine Unschärfe entsteht. Durch den Einbau von zusätzlichen Linsen wird die Bildwölbung korrigiert --> Plankorrektur (Plan). Beste Linsen daher mit Bezeichnung Plan-Apo.

Definition des Auflösungsvermögens eines Objektivs und der Lichtstärke.

Anders ausgedrückt: Das Vermögen eines optischen Elements Licht zu Fokussieren.

Je höher der Wert der NA:

• Desto höher die Auflösung.
• Umso mehr Licht kann für die Anregung der Fluoreszenz verwendet werden.
• Umso geringer der Schärfentiefe (Ausdehnung des scharf fokussierten Bereichs).
• Umso geringer meist der Arbeitsabstand.

NA charakterisiert durch:

NA= n x sinα

Lichtbrechungskoeffizient (n) des Mediums zwischen Objektiv und Präparat (Luft, n=1).

und dem Sinus (sin) des halben Öffnungswinkels (α) des Objektivs zur optischen Achse (sinα).

In Luft -> NA<1, max 0.95 (1xsin73°).

Die numerische Apertur wird vergrössert durch einen grösseren Öffnungswinkel des Objektivs (sinα) oder durch einen höheren Brechhungsindex des (Immersions-) Mediums. Lichtbrechungskoeffizient des Mediums (n) mit Brechungsindex muss grösser als eins sein.

Wasser n=1.33 -> NA 1.2

Glycerin n=1.47

Öl n=1.51 -> NA 1.4

Kleinster Abstand zwischen zwei Objektstrukturen, bei dem diese noch getrennt wahrgenommen werden können.

Abbe Limit: Ein Lichtmikroskop kann keine Strukturen abbilden, die näher zusammenliegen als die halbe Wellenlänge des verwendeten Lichts.

Full Width at Half Maximum. Zur experimentellen Bestimmung der Auflösung eines Mikroskops.

Bei einem Goldbead wird zuerst das Fluoreszenzmaximum und dann der Durchmesser des Beads bei halbem Fluoreszenzmaximum bestimmt. FWHM ist je nach Wellenlänge grösser oder kleiner. Je höher die Wellenlängen desto kleiner die Auflösung.