Molekulare Zellbiologie I (Stofftransport)

· "gleich bleibend"

· Flüssigkeitsvolumen, Ionenkonzentrationen, pH-Wert, Temperatur etc. werden konstant gehalten

· EZF wird von verschiedenen Organen reguliert / IZF wird von jeder Zelle selbst reguliert

· Abweichungen (externe oder interne Gründe) führen zum Verlust der Homöostase

  → nicht erfolgreiche Kompensation führt zu Krankheit

· Regulation der Homöostase:

  · negative Rückkopplung: Körper wird ins Gleichgewicht gebracht (z.B. Körpertemperatur / Blutdruck / Blutzucker)

  · positive Rückkopplung: Ereignis A löst Ereignis B aus, das wiederum Ereignis A verstärkt → bis Ziel erreicht

    · kommt nur selten im Organismus vor

· Austauschfläche von 300m²

  · ~15 Liter pro Tag werden filtriert (filtriertes Volumen Q = L_p · A · P_eff / mit L_p = hydraulische Leitfähigkeit)

   · 9/10 werden wieder reabsorbiert

   · 1/10 geht in die Lymphgefässe

· Stoffaustausch ist begrenzt durch:

  · Diffusion (diffusionslimitiert)

  · Nachschub (perfusionslimitiert)

· Grundprinzipien:

  · Elektroneutralität

  · Egalität der Ionenprodukte (der diffusiblen Ionen)

→ es entsteht ein osmotisches Ungleichgewicht

    → hydrostatischer (∆p) und kolloidosmotischer Druck (∆π) bestimmen Richtung und Grösse der Lösungsmitteldiffusion

        (P_eff = ∆p - ∆π)

· p = c · R · T     (c = Konzentration  /  R = universelle Gaskonstante  /  T = absolute Temperatur)

· Osmolarität (Plasma):  \(290 \space { mosmol \over l \space Lösung}\)

· Osmolalität (Plasma):  \(290 \space { mosmol \over kg \space H_2O}\)

· Plasma und intrazelluläre Lösung sind isoosmotisch → Erythorzyten können als Osmometer verwendet werden

· Flüssigkeit im Interstitium

· Ursache: Ungleichgewicht zwischen Filtration und Resorption

  · z.B.: Anstieg des Kapillardruckes / Zunahme der Kapillarpermeabilität / Blockierung des Lymphabflusses

· kontinuierlicher Typ:

  · transzelluläre Diffusion (lipohpile Moleküle) / parazelluläre Spalten / wenig permeabel für hydrophile Moleküle

  · Vorkommen: Lunge / Muskel / Fettgewebe / Gehirn

· fenestrierter Typ:

  · transzelluläre Poren (ø 50nm / teils mit Diaphragma) / parazelluläre Spalten / gut permeabel für Wasser

  · Vorkommen: Glomeruli der Niere / exokrine Drüsen / Darmschleimhaut / Plexus choroideus

· diskontinuierlicher Typ:

  · inter- und intrazelluläre Lücken (ø -1µm) / Durchritt von Makromolekülen und Zellen möglich

  · perforierte Basalmembran

  · Vorkommen: Sinusoide von Leber, Milz und Knochenmark

· freie Energie eines Konzentrationsgradienten:

  · ungeladene Teilchen (chemisches Potential):          \(\Delta G = -R·T · ln {c_1 \over c_2}\)  (c₁ > c₂)

  · geladene Teilchen (elektrochemisches Potential): \(\Delta G = R · T · ln {X_2 \over X_1} + z_x · F · \Delta \psi\)  (z = Ladung / ψ = Membranpotential)

· Nernst Potential (Gleichgewichtspotential / ∆G = 0)

  · \(E_x = \Delta \psi_x = {-R·T \over z_x · F} ·ln {X_2 \over X_1}\)

· Lipiddoppelschicht hat die Eigenschaften eines elektrischen Widerstands und eines Kondensators

· Ruhepotential über der Membran beträgt -80 bis -60 mV (liegt in der Nähe des Kalium-Gleichgewichts-Potentials)

· Potentialdifferenz wird ermöglicht durch:

  · unterschiedliche Ionenverteilung / Proteinkonzentration

  · unterschiedliche Membranpermeabilitäten (für K⁺ gross / für Na⁺ klein)

· beschreibt den Gleichgewichtszustand (kein Nettofluss)

· für eine Ionensorte gilt: \(E_G = - {60mV \over z} · ln {c_{intra} \over c_{extra}} \) (Nernst-Gleichung / E_G = ∆G = Energie, die Arbeit verrichten kann)

· ist die Membran für mehrere Ionensorten durchlässig, gilt die Goldmann-Hodgkin-Katz Gleichung:

  \(E_i = {R·T \over F } · ln ({P_K[K^+]_a + P_{Na}[Na^+]_a + P_{Cl}[Cl^-]_\textbf{i}\over {P_K[K^+]_i + P_{Na}[Na^+]_i + P_{Cl}[Cl^-]_\textbf{a}}})\). (P = Ionen-Permeabilitäten)

· \(J_x = {dN \over dt} = -D_x · A · {\Delta c \over \Delta x}\)  (J_x = Flux = Stofffluss in mol · s^-1 / A = Durchtrittsfläche / ∆x = Diffusionsstrecke)

· \(D = {k · T \over 6 \pi \eta r } \)  (Diffusionskoeffizient / Einstein-Stokes Beziehung / r = Molekülradius / η = Viskosität)

· Diffusionsrate = Oberfläche x Konzentrationsgradient x Membranpermeabilität ÷ Membrandicke

· Teilchenfluss: Fick'sches Diffusionsgesetz (Konzentrationsgradient als Triebkraft)

· Volumenfluss: \(J_{H_2O} [ml/s] = L_p · A · \Delta p\)  (L_p = hydraulische Leitfähigkeit / Druckdifferenz als Triebkraft)

· freie Diffusion (abhängig vom Konzentrationsunterschied / z.B. Gase)

· erleichterte Diffusion (mit Membranproteinen / spezifisch / reguliert)

  · aktiv (gegen das Konzentrationsgefälle)

    · primär aktiv

    · sekundär aktiv

  · passiv (mit dem Konzentrationsgefälle)

    · Transporter (gemäss Michaelis-Menton-Gleichung)

    · Poren (immer offen)

    · Kanäle (offen oder geschlossen)

· Triebkraft: Konzentrationsgradient / Entropiezunahme

· ohne spezielle Membranproteine

· ist nicht sättigbar

· kann nicht gehemmt werden

· Beispiele: Gase / Steroidhormone / lipophile Vitamine

· Membranprotein für Transport (kann mehr oder weniger spezifisch sein / kann inhibitiert werden)

  · aktiver Transport: transportiert Stoffe gegen den elektrochemischen Gradient

  · passiver Transport: erleichtern Transport in Richtung des elektrochemischen Gradient

· schneller als freie Diffusion

· Kinetik ist abhängig von der Sättigung / v_max ist begrenzt

· besteht aus vier Transmembranproteinen

  · jedes Aquaporin-Protein besitzt einen Wasserkanal

  · Arg195 sorgt für elektrostatische Repulsion

  · His180 schränkt Molekülgrösse ein

  · Asn192 und Asn 76 orientieren Wasserdipole richtig

· Aquaporin-1 lässt 3 Milliarden Wassermoleküle pro Sekunde passieren

· passiver Transport

· regulatorisch / selektiv (Proteinschleifen passen Porenöffnung an Ionendurchmesser an)

· wichtig für schnelle Änderungen des Membranpotentials

· Untereinheiten bestehen aus Homo- oder Heteromeren

· je nach Art des Ionenkanals wird er gesteuert über...

  ... Liganden (Konformationsänderung durch Bindung eines Liganden)

  ... Spannung (Änderung des Membranpotentials)

  ... Zug und Druck (über das Zytoskelett)

  ... Phosphorylierung des Transporters

· Spannungs-gesteuerter Ionenkanal (Halbaktivierungspotential bei -20mV)

   · mögliche Zustände: offen / inaktiv / geschlossen

   · Kanalpore liegt in der α-Untereinheit (besteht aus 4 Proteindomänen, die je 6 Transmembranregionen besitzen)

   · Zusatzuntereinheiten (β-subunits) regulieren die Funktion

· Spannungssensible α-Helices* öffnen als Reaktion auf die Depolarisierung den Kanal (innerhalb 0.1ms)

· offener Kanal wird nach ~1ms inaktiviert (NH₂-Gruppe des Proteins "verstopft" den Kanal)

· nach der Repolarisation wird der inaktive Kanal wieder geschlossen

· Pharmakologie: viele Gifte binden an spannungsgesteuerte Ionenkanäle

  · Beispiele: Tetrodotoxin des Kugelfisches / Lokalanästhetika (z.B. Lidocain) blockieren Natriumkanäle

* α-Helices mit positiven AS werden durch Depolarisation "verschoben", was zu einer Konformationsänderung führt

· Spannungs-gesteuerter Ionenkanal (Halbaktivierungspotential bei -10mV)

   · mögliche Zustände: offen / geschlossen

   · Ionenkanal besteht aus 4 Kanalproteinen (Tetramer / mit jeweils 2-7 TMRs)

· während der Depolarisation nimmt der Kaliumausstrom "logarithmisch" zu (bis Imax)

   → führt zur Hyperpolarisation

· Kanal wird nach der Repolarisation sofort geschlossen

· Kinozilien der Zellen im Ohr, werden durch Schall in Schwingung versetzt und deformieren sich dadurch

  · über das Zytoskelett werden Kanäle geöffnet, und Ca²⁺ kann als Neurotransmitter ausgeschüttet werden

· ionotropisch

  · Rezeptorbindungsstelle befindet sich am Kanalprotein

    → Ligandenbindung öffnet den Ionenkanal (durch Konformationsänderung) → schnelle Reaktion möglich

    · Kanalprotein besteht aus 4-5 Untereinheiten

    · Transmitter dissoziiert wieder vom Rezeptor oder Kanal wird desensitisiert (Transmitter gebunden, Kanal geschlossen)

  · meistens postsynaptisch

· metabotropisch (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren*)

  · Rezeptorbindungsstelle setzt ein messenger-Protein (G-Protein) frei, das an Ionenkanal bindet

    → Ligandenbindung löst intrazelluläre Signalkaskade aus → Reaktionszeit dauert länger

    · Rezeptorbindungsstelle ist ein monomeres Protein mit 7 Transmembransegmenten

    · G-Proteine binden an die intrazelluläre Schleife zwischen der Domäne III und IV und die C-terminale Region

  · prä- und postsynaptisch 

  · v.a. für kleine Neurotransmitter (Glutamat / GABA / ACh / Serotonin)

* es gibt auch Enzym-gekoppelte Rezeptoren (z.B. Rezeptor-Tyrosinkinasen)

· ermöglichen erleichterte, passive Diffusion (100 - 10'000 Moleküle pro Sekunde)

· besitzen zwei "Türen", die nie gleichzeitig geöffnet sind / funktionieren wie eine Schleuse

· Kinetik gehorcht der Michaelis-Menton-Gleichung / Transporter sind sättigbar

· Arten von Transporter:

  · Uniporter: Substrat wird entlang des Konzentrationsgradienten transportiert (Bsp: GLUT1 in Erythrozyten)

  · Symporter*: wie Uniporter, aber gleichzeitig wird ein anderes Substrat in die gleiche Richtung, aber gegen den Konzentrationsgradienten transportiert (Bsp:  SGLT, Na⁺/Glucose-Cotransporter)

  · Antiporter*: wie Symporter, aber das "zweite" Substrat wird in die entgegengesetzte Richtung gegen den Konzentrationsgradienten transportiert (Bsp: NCX, Na⁺/Ca²⁺-Tauscher)

* sekundär aktiver Transport

· ermöglicht Tranport gegen den Konzentrationsgradienten (unter Verbrauch von metabolischer Energie)

  · primär aktiver Transport: Energie und Transport sind direkt miteinander verknüpft (ATPase / ABC-Transporter)

  · sekundär aktiver Transport: indirekte Kopplung zwischen Energie und Transport (z.B. Na/Glucose-Symporter)

· P-class Pumpen (in der Plasmamembran)

  · Na⁺/K⁺-ATPase (in jeder Zelle vorhanden / 3 Na⁺ raus / 2 K⁺ rein / verbraucht >25% des ATPs / α,β,γ - subunits)

  · Ca²⁺-ATPase (auch in der ER-Membran vorhanden)

· V-class Protonen-Pumpen (u.a. in vakuolären Membranen / für Ansäuerung des Lumens / nicht phosphoryliert)

  · V-ATPase (in Lysosomen / ermöglichen saures lysosomales Lumen / säuert Urin an zur Bakterienbekämpfung)

· F-class Protonen-Pumpen (u.a. in der inneren Mitochondrienmembran / ähnlich wie V-class Protonen-Pumpen)

· ABC Superfamilie (ABC = ATP-Binding-Cassette)

  · ABC Transporter (Phospholipid-Transporter / Transport toxischer Substanzen aus Zelle / sehr resistentes Protein)

    · Beispiel für ABC-Transporter: CFTR (cystic fibrosis transmembran regulator)

· kein ATP-Verbrauch

· Symporter: wie Uniporter, aber gleichzeitig wird ein anderes Substrat in die gleiche Richtung, aber gegen den Konzentrationsgradienten transportiert (Bsp:  SGLT, Na⁺/Glucose-Cotransporter)

· Antiporter: wie Symporter, aber das "zweite" Substrat wird in die entgegengesetzte Richtung gegen den Konzentrationsgradienten transportiert (Bsp: NCX, Na⁺/Ca²⁺-Tauscher)

· Beispiel SGLT (Sodium-Glucose-CoTransporter):

  · D-Glucose kann gegen eine bis zu 100fache grössere Konzentration transportiert werden

· elektrogener Transport (erzeugt eine elektrische Spannung)

  · 3 Na⁺ nach aussen / 2 K⁺ nach innen    (Merkhilfe: 3 Nazis raus - 2 Kumpels rein)

  · verbraucht 1 ATP  (Na⁺/K⁺-ATPase verbraucht mehr als ¼ bzw. ⅓ des ATPs)

· Ouabain (g-Strophantin) ist ein hochspezifischer Na⁺/K⁺-ATPase - Blocker

· Zellen ohne feste Zellwand können hydrostatischen Druckunterschieden nicht standhalten

· Volumenänderungen verursachen mechanische Spannungen in der Zelle

  → dehnungsaktivierte Kinasen / (PP-1) Phosphatasen bewirken einen Teilchenstrom in die Zelle / aus der Zelle

· akute Änderungen der extrazellulären Osmolalität führen zu RVI bzw. RVD:

  · regulatory volume increase: Ionen werden in die Zelle gepumpt → Wasser zieht nach

  · regulatory volume decrease: Ionen werden aus der Zelle gepumpt → Wasser geht raus

· chronische Änderungen bewirken eine Konzentrationsänderung der intrazellulären organischen Osmolyten*

  · die Zelle synthetisiert organische Osmolyten oder baut sie ab

  · die organischen Osmolyten lassen sich in drei Gruppen einteilen: Aminosäuren / Polyalkohole / Methylamine

* z.B. Betain / Taurin 

· transzellulär

  · erleichterte Diffusion / primär aktiver Transport / sekundär aktiver Transport

  · benötigt eine niedrige intrazelluläre Na⁺-Konzentration (für Symport / Antiport mit Na⁺-Ionen)

· parazellulär

  · Poren in den Tight Junctions → selektiv (für Ca²⁺ / Mg²⁺ / Wasser / ... )

  · Claudine spielen eine wichtige Rolle im parazellulären Transport

· allgemein Bioelektromagnetismus

· Bioelektrizität umfasst alle elektrischen Phänomene in Lebewesen, die durch elementare elektrische Ströme in Zellen entstehen

· EKG (Elektrokardiogramm) → Herzschlag

· EMG (Elektromyogramm) → Muskelaktivität

· EOG (Elektrookulogramm) → Augenbewegung

· EEG (Elektroenzephalogramm) → Hirnrindenaktivität

· ERG (Elektroretinogramm) → Netzhautfunktion

· Skala:

  · makroskopische Phänomene (EKG, EEG, ...)

  · zelluläre / molekulare Phänomene (Ruhe- und Aktionspotential / Ionenkanäle)

· Modus:

  · elektrische Messung (EKG, EMG, ...)

  · elektrische Reizung (Defibrillator, ...)

· Patch-Clamp-Technik (s. Bild)

  · eine Glaspipette (ø ~50µm) mit Elektrolyt wird an Zelle "angebracht"

  · Rauschunterdrückung mittels Gigaseals (sehr hoher Widerstand zwischen Membran und Pipette)

  · Inside-out Konfiguration ermöglicht das Verändern der cytosolischen Zusammensetzung

  · Outside-out Konfiguration ermöglicht das Verändern der extrazellulären Zusammensetzung

· ermöglicht Messung von Strömen einzelner Ionenkanäle

· anhand unterschiedlicher Stromamplituden kann auf die Anzahl gemessener Ionenkanäle zurückgeschlossen werden