Biotechnologie 3.2
Isolierung von Nukleinsäuren, Isolierung von RNA, Bestimmung der NS-Konzentration
Isolierung von Nukleinsäuren, Isolierung von RNA, Bestimmung der NS-Konzentration
Fichier Détails
| Cartes-fiches | 11 |
|---|---|
| Langue | Deutsch |
| Catégorie | Biologie |
| Niveau | Apprentissage |
| Crée / Actualisé | 23.12.2013 / 05.10.2017 |
| Lien de web |
https://card2brain.ch/box/biotechnologie_3_2
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| Intégrer |
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Isolierung von Nukleinsäure (3 Schritte)
1. Bereitstellen und Aufschließen der Zelle
2. Entfernen aller Zellbestandteile außer der genetischen Nukleinsäure
3. Reinigung und Aufkonzentrieren der Nukleinsäure
wichtige Bestandteile des Extraktionspuffers
1. EDTA: bindet Me2+ (z.B.: Mg 2+)-Ionen
Inaktivierung von Nukleasen
2. Tris-HCl: (hydroxymethyl)-aminomethan:
als pH-Puffer
3. SDS: sodium dodecyl sulfat:
Detergenz zum Auflösen von Membranen; Abtrennen von DNA-gebundenen Proteine (Histone)
4. Zusätze:
- ß-Mercaptoethanol: bricht S-S-Bindungen in Proteinen auf
- Triton x100: Guanindinthiocyanat: erleichtert die Extraktion
Wichtig: Salzkonzentration im Puffer darf nicht weniger als 0,5 M NaCl sein, sonst wird die DNA mitausfallen.
1. Bereitstellen und Aufschließen der Zellen
(Isolierung der Nukleinsäure)
1. Auswahl von jungen, frischen, gesunden, sauberen Material (evtl. waschen)
2. Aufschluss des Materials (Mörser+Pestill+Seesand)
Problem: Zellaufschluss setzt DNasen und RNasen frei
Aushilfe:
- Meterial mit flüssigen Stickstoff schockfrieren
- Zellmaterial mit Mörser/Pestill oder Kugelmüle zermahlen
- Gefriertrocknung, dann Zerkleinern des Materials auch bei Raumtemperatur möglich (Mahlen), kann dann auch gelagert werden
- zügig (zum gefrorenen Material) Zugabe eines Extraktionspuffers → Hemmung von Nukleasen durch EDTA
- Inkubationszeit für 30-60min bei 60-65°C unter Schwenken (Wichtig: zügig arbeiten bis zur Zugabe des Extraktionspuffers, um einen Abbau der Nukleinsäure zu verhindern)
2. Abtrennung von Zellbestandteilen außer der DNA
(Isolierung der Nukleinsäure)
1. Abtrennen von Kohlenhydrate/Polysachharide (CTAB)
2. Abtrennen von RNA (RNasen)
3. Abtrennen von Proteinen (Proteinase K, SDS, Phenol-Extraktion oder Chloroform-Isomylalkohol)
4. Nach Proteinextraktion wird zentrifugiert, es bilden sich 3 Phasen
-obere Phase: wässirige Phase, in der DNA+RNA gelöst sind; leichte Entnahme mit Pipette
- Interphase: ausgefüllte Proteine, Polysaccharide, Zellbestandreste, ungelöste Zelltrümmen
- untere Phase: organische Phase mit lipid-löslichen Zellbestandteilen, die sich in organ. Lösungsmitteln lösen.
Abtrennen von Kohlenhydrate/Polysacchariden (Schritt 2)
CTAB (cethyltrimethylammoniumbromid)
- besonders wichtig bei kohlenhydratreichen Material
- bindet unlösliche Komplexe mit Polysacchariden → Ausfällung (Zusatz zum Extraktionspuffer möglich)
Durchführung von Phenol-Extraktion (2.Schritt)
- Phenol bzw. Chloroform-Isoamyl zu Extraktionsansatz geben (ca. 0,6-1 Vol Teile)
- gut mischen
- ca. 30 min. inkubieren (unter Schwenken)
3. Reinigung und Aufkonzentrieren der AS
(Isolierung der Nukleinsäure)
- Zugabe von Alkohol (Ethanol oder Isopropanol = 2Propanol) bei Anwesenthiet von Natriumionen NH4+ (=Ammonium)-Ionen
→ entzieht der NS die Hydrathülle
→ NS fällt aus
→ Alkohol Präzipitation
- Nach der Fällung: waschen der DNA mit 70% Ethanol, um mitgefälltes Salz zu entfernen
- DNA trocknen, um Alkoholreste zu entfernen
- im entsprechenden Puffer (Tris-HCl; EDTA; Puffer) / Wasser lösen
Verwendung von Ethanol
(Isolierung der Nukleinsäure)
- absoluter Alkohol auf -20°C vorgekühlt
- Zusatz von 2,5 Vol. Anteile zur DNA-Lsg.; überschichten
⇒ DNA fällt an der Grenzschicht aus, kann mit dem Glashacken "geangelt" werden (hochmolekulare DNA)
⇒ niedermolekulare DNA: Ansatz für 30 min bei -20°C inkubieren, dann bei 4°C abzentrifugieren.
Verwendung von Isopropanol
(Isolierung der Nukleinsäure)
- Fällung bei Raumtemperatur, Zugabe von 0,6 Vol. Anteile Alkohol
- Zentrifugieren nach Durchmischung
- hochmolekulare DNA "angeln"
Isolierung von RNA
- Ablauf prinzipiell wie DNA-Extraktion, aber
1. Abbau der DNA durch DNase-Behandlung
2. Gefahr durch RNasen → nich durch EDTA inaktivierbar, nicht durch Hitze inaktivierbar
⇒ Inaktivierung durch DEPC-Zusatz
Bestimmung der NS-Konzentration
1. Bestimmung der optischen Dichte/Absorbtion
- Eine Absorbtion gemessen bei 260nm von 1,0 entspricht einer Konzentration von 50 ng/µl ds DNA bzw. 40 ng/µl RNA
2. Bestimmung der Reinheit der DNA durch Vergleich E260 zu E280
NS: Absorbtionsmax bei 260 nm
Proteine: Absorbtionsmax bei 280 nm
⇒ Quotient aus E260 / E280 (Aussage über die Reinheit d. DNA)
protein frei:
DNA: E260 / E280 = 1,7-2,0
RNA: E260 / E280 = 1,9-2,1
3. Vergleich d. Bandenintensivität der unbekannten DNA-Konzentration mit den Bestandteilen eines DNA-Massenstandarts nach Gelelektophorese
