Biotechnologie 3.2

1. EDTA: bindet Me²⁺ (z.B.: Mg ²⁺)-Ionen

Inaktivierung von Nukleasen

2. Tris-HCl: (hydroxymethyl)-aminomethan:

als pH-Puffer

3. SDS: sodium dodecyl sulfat:

Detergenz zum Auflösen von Membranen; Abtrennen von DNA-gebundenen Proteine (Histone)

4. Zusätze:

- ß-Mercaptoethanol: bricht S-S-Bindungen in Proteinen auf

- Triton x100: Guanindinthiocyanat: erleichtert die Extraktion

Wichtig: Salzkonzentration im Puffer darf nicht weniger als 0,5 M NaCl sein, sonst wird die DNA mitausfallen.

1. Auswahl von jungen, frischen, gesunden, sauberen Material (evtl. waschen)

2. Aufschluss des Materials (Mörser+Pestill+Seesand)

Problem: Zellaufschluss setzt DNasen und RNasen frei

Aushilfe:

- Meterial mit flüssigen Stickstoff schockfrieren

- Zellmaterial mit Mörser/Pestill oder Kugelmüle zermahlen

- Gefriertrocknung, dann Zerkleinern des Materials auch bei Raumtemperatur möglich (Mahlen), kann dann auch gelagert werden

- zügig (zum gefrorenen Material) Zugabe eines Extraktionspuffers → Hemmung von Nukleasen durch EDTA 

- Inkubationszeit für 30-60min bei 60-65°C unter Schwenken (Wichtig: zügig arbeiten bis zur Zugabe des Extraktionspuffers, um einen Abbau der Nukleinsäure zu verhindern)

1. Abtrennen von Kohlenhydrate/Polysachharide (CTAB)

2. Abtrennen von RNA (RNasen)

3. Abtrennen von Proteinen (Proteinase K, SDS, Phenol-Extraktion oder Chloroform-Isomylalkohol)

4. Nach Proteinextraktion wird zentrifugiert, es bilden sich 3 Phasen

-obere Phase: wässirige Phase, in der DNA+RNA gelöst sind; leichte Entnahme mit Pipette

- Interphase: ausgefüllte Proteine, Polysaccharide, Zellbestandreste, ungelöste Zelltrümmen

- untere Phase: organische Phase mit lipid-löslichen Zellbestandteilen, die sich in organ. Lösungsmitteln lösen.

CTAB (cethyltrimethylammoniumbromid)

- besonders wichtig bei kohlenhydratreichen Material

- bindet unlösliche Komplexe mit Polysacchariden → Ausfällung (Zusatz zum Extraktionspuffer möglich)

- Phenol bzw. Chloroform-Isoamyl zu Extraktionsansatz geben (ca. 0,6-1 Vol Teile)

- gut mischen

- ca. 30 min. inkubieren (unter Schwenken)

- Zugabe von Alkohol (Ethanol oder Isopropanol = 2Propanol) bei Anwesenthiet von Natriumionen NH₄⁺ (=Ammonium)-Ionen 

→ entzieht der NS die Hydrathülle

→ NS fällt aus

→ Alkohol Präzipitation

- Nach der Fällung: waschen der DNA mit 70% Ethanol, um mitgefälltes Salz zu entfernen

- DNA trocknen, um Alkoholreste zu entfernen

- im entsprechenden Puffer (Tris-HCl; EDTA; Puffer) / Wasser lösen

- absoluter Alkohol auf -20°C vorgekühlt

- Zusatz von 2,5 Vol. Anteile zur DNA-Lsg.; überschichten

⇒ DNA fällt an der Grenzschicht aus, kann mit dem Glashacken "geangelt" werden (hochmolekulare DNA)

⇒ niedermolekulare DNA: Ansatz für 30 min bei -20°C inkubieren, dann bei 4°C abzentrifugieren.

- Fällung bei Raumtemperatur, Zugabe von 0,6 Vol. Anteile Alkohol

- Zentrifugieren nach Durchmischung

- hochmolekulare DNA "angeln"

- Ablauf prinzipiell wie DNA-Extraktion, aber

1. Abbau der DNA durch DNase-Behandlung

2. Gefahr durch RNasen → nich durch EDTA inaktivierbar, nicht durch Hitze inaktivierbar

⇒ Inaktivierung durch DEPC-Zusatz

1. Bestimmung der optischen Dichte/Absorbtion

- Eine Absorbtion gemessen bei 260nm von 1,0 entspricht einer Konzentration von 50 ng/µl ds DNA bzw. 40 ng/µl RNA

2. Bestimmung der Reinheit der DNA durch Vergleich E₂₆₀ zu E₂₈₀

_{NS: Absorbtionsmax bei 260 nm}

Proteine: Absorbtionsmax bei 280 nm

⇒ Quotient aus E₂₆₀ / E₂₈₀ (Aussage über die Reinheit d. DNA)

protein frei:

DNA: E₂₆₀ / E_{280 = 1,7-2,0}

RNA: E₂₆₀ / E_{280 = 1,9-2,1}

_{3. Vergleich d. Bandenintensivität der unbekannten DNA-Konzentration mit den Bestandteilen eines DNA-Massenstandarts nach Gelelektophorese}