Bakteriengenetik Teil 4

Der alpha Komplementationstest wird dazu verwendet eine Bakterienkolonie auf Transformation von Plasmid mit Insert zu testen:

Beta- Galactosidase, das Genprodukt der LacZ-Gene besteht aus zwei Komponenten: LacZ- alpha und LacZ- omega nur wenn beide Komponenten funktional vorhanden, kann Galactosidase ihre katalytische Wirkung entfalten.

Funktionsweise:

• E. coli Stamm, der eine lacZ- aplpha Deletion aufweist.
• Zur Transformation wird ein Plasmid verwendet, welches eine lacZ- alpha Fragment enthällt (als scorable Marker)
• Nur bei erfolgreicher Transformation des Plasmides in die Zelle kann funktionsfähige beta-Galactosidase exprimiert werden.
• Durch ein Insert ins Plasmid wiederum wird das alpha- Fragment zerstört und es kommt bei Transforamtion zu keiner funktionsfähigen Galactosidase.
• Plattieren der Zellen auf Selektionsmedium, dass IPTG ( Macht lac-Repressor inaktiv und ermöglicht ablesen der lacZ- gene) und X-Gal (Substrat der betaGalactosidase, dass bei Spaltung blaues Produkt aufweist) enthällt.
  • Keine alpha – Komplementation, also keine Galactosidase Funktion, weil Insert in das Plasmid
  • Weiße Kolonien
  • Transformation mit Plasmid aber kein Insert ins Plasmid
  • alpha Komplementation
  • Galcatosidase Aktivität
  • X-Gal Spaltung
  • Blaue Kolonien

Um aus Stärke Ethanol herstellen zu können, muss das Polysaccharid zuerst in 
Glucosemonomere gespalten werden. Hierfür werden Amylasen, benötigt, die zum 
Beispiel aus Aspergillus gewonnen werden können. Anschließend wird der so entstandene 
Zucker durch entsprec´hende Bakterien oder Hefen fermentiert, sodass Ethanol entsteht. 
Dieses wird aus der Mischung dann durch Destillation und Verdampfung entfernt. 
Für das Betreiben einer Biogasanlage sind des weiteren Enzyme nötig, welche Cellulose 
abbauen können, wie Cellulasen und Hemicellulasen. Diese werden zum Beispiel aus 
Trichoderma gewonnen. Polysaccharide werden jedoch zur Biogasherstellung oft noch 
nicht genutzt. Stattdessen werden Proteine, Lipiode und Monosaccharide zuerst in 
Monomere zerlegt und anschließend zu Methan abgebaut. Pseudomonas können in der Biomasse enthaltene Schadstoffe abbauen. Methanogene Bakterien verstoffwechseln dann 
die C5- und C6-Zucker fermentativ zu Methan, also Biogas.  

Eine denkbare Erklärung wäre, dass das Plasmid oder das Gen auf dem Chromosom in der 
Zelle verändert wurde und das Gen, welches die Zelle komplementiert, dadurch 
ausgeschalten oder sonst wie unfunktionell gemacht wurde. Das Insert ist trotzdem noch 
da, aber der Nachweis über die Weißverfärbung ist aufgrund der Mutation auf dem 
Plasmid oder sogar auf dem zu komplementierenden Gen auf dem Chromosom nicht 
nachweisbar.

Die luxAB-Kassette codiert für die Luciferase, ein Enzym das unter Vorhandensein von 
Sauerstoff und Verbrauch von ATP ein Substrat (z.B. Luciferin) in einer Lichtreaktion 
umsetzt. Der Nachteil dabei ist, dass dieses Enzym um leuchten zu können sowohl 
Sauerstoff braucht (deshalb kann es in anaeroben Bakterien evtl. schlecht eingesetzt 
werden) als auch Energie in Form von ATP und das entsprechende Substrat (was des 
Stoffwechsel der Zelle belastet bzw. eventuell extra dazugegeben werden muss).

Homologe Rekombination kann normalerweise nur stattfinden, wenn die beiden zu 
rekombinierenden Sequenzen ausreichend große Komplementarität aufweisen. Nur bei 
ausreichend großer Sequenzähnlichkeit dann können sich die homologen Stränge der 
Nicht-Schwesterchromatiden paaren, um die Rekombination zu ermöglichen. Dafür 
müssen die homologen Chromosomen auch nebeneinander angeordnet sein, sodass 
homologe Abschnitte miteinander paaren können.

Es gibt das Holliday-Modell, bei dem die Doppelstränge ein Rekombinationkreuz bilden, 
welches sich durch Isomerisierung umlagern kann. Dabei wird entweder ein Teil eines 
Einzelstrangs oder der Doppelstrang von einem Chromatiden auf einen anderen 
übertragen werden.  
Das Meselson/Radding-Modell beschreibt das Eindringen eines Einzelstrangs um einen 
der Stränge im Nicht-Schwesterchromatid zu ersetzen. Der ersetzte Einzelstrang ersetzt 
dann den zuerst eindringenden Einzelstrang.  
Das Modell nach Szostak und Stahl besdchreibt, wie ein Doppelstrangbruch repariert 
werden kann. Dafür ersetzt einer der überhängend abgebrochenen Einzelstränge einen der 
Stränge des unbeschädigten homologen Doppelstrangs und kann somit aufgrund des 
homologen Einzelstrangs über die Bruchstelle hinaus verlängert werden. Der abgelöste 
Template-Strang ermöglicht währenddessen eine Verlängerung der anderen Seite der 
Bruchstelle.