Bakteriengenetik Teil 4
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Kartei Details
Karten | 11 |
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Sprache | Deutsch |
Kategorie | Biologie |
Stufe | Universität |
Erstellt / Aktualisiert | 28.01.2015 / 27.05.2017 |
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Beschreiben sie die Grundlagen des alpha- Komplementationstests (Funktionsprinzip, Verwendung, Detektion)
Der alpha Komplementationstest wird dazu verwendet eine Bakterienkolonie auf Transformation von Plasmid mit Insert zu testen:
Beta- Galactosidase, das Genprodukt der LacZ-Gene besteht aus zwei Komponenten: LacZ- alpha und LacZ- omega nur wenn beide Komponenten funktional vorhanden, kann Galactosidase ihre katalytische Wirkung entfalten.
Funktionsweise:
- E. coli Stamm, der eine lacZ- aplpha Deletion aufweist.
- Zur Transformation wird ein Plasmid verwendet, welches eine lacZ- alpha Fragment enthällt (als scorable Marker)
- Nur bei erfolgreicher Transformation des Plasmides in die Zelle kann funktionsfähige beta-Galactosidase exprimiert werden.
- Durch ein Insert ins Plasmid wiederum wird das alpha- Fragment zerstört und es kommt bei Transforamtion zu keiner funktionsfähigen Galactosidase.
- Plattieren der Zellen auf Selektionsmedium, dass IPTG ( Macht lac-Repressor inaktiv und ermöglicht ablesen der lacZ- gene) und X-Gal (Substrat der betaGalactosidase, dass bei Spaltung blaues Produkt aufweist) enthällt.
- Keine alpha – Komplementation, also keine Galactosidase Funktion, weil Insert in das Plasmid
- Weiße Kolonien
- Transformation mit Plasmid aber kein Insert ins Plasmid
- alpha Komplementation
- Galcatosidase Aktivität
- X-Gal Spaltung
- Blaue Kolonien
Welche Bakterien/Enzyme werden zum Betreiben einer Biogasanlage benötigt? Welche
zur Herstellung von Industriealkohol aus Stärke?
Um aus Stärke Ethanol herstellen zu können, muss das Polysaccharid zuerst in
Glucosemonomere gespalten werden. Hierfür werden Amylasen, benötigt, die zum
Beispiel aus Aspergillus gewonnen werden können. Anschließend wird der so entstandene
Zucker durch entsprec´hende Bakterien oder Hefen fermentiert, sodass Ethanol entsteht.
Dieses wird aus der Mischung dann durch Destillation und Verdampfung entfernt.
Für das Betreiben einer Biogasanlage sind des weiteren Enzyme nötig, welche Cellulose
abbauen können, wie Cellulasen und Hemicellulasen. Diese werden zum Beispiel aus
Trichoderma gewonnen. Polysaccharide werden jedoch zur Biogasherstellung oft noch
nicht genutzt. Stattdessen werden Proteine, Lipiode und Monosaccharide zuerst in
Monomere zerlegt und anschließend zu Methan abgebaut. Pseudomonas können in der Biomasse enthaltene Schadstoffe abbauen. Methanogene Bakterien verstoffwechseln dann
die C5- und C6-Zucker fermentativ zu Methan, also Biogas.
Sie nutzen die blau/weiß-Selektion für eine Klonierung. Sie stellen fast, dass auch
einige der blauen Kolonien ein Insert tragen. Warum?
Eine denkbare Erklärung wäre, dass das Plasmid oder das Gen auf dem Chromosom in der
Zelle verändert wurde und das Gen, welches die Zelle komplementiert, dadurch
ausgeschalten oder sonst wie unfunktionell gemacht wurde. Das Insert ist trotzdem noch
da, aber der Nachweis über die Weißverfärbung ist aufgrund der Mutation auf dem
Plasmid oder sogar auf dem zu komplementierenden Gen auf dem Chromosom nicht
nachweisbar.
Welchen Nachteil hat die Verwendung der luxAB-Kassette?
Die luxAB-Kassette codiert für die Luciferase, ein Enzym das unter Vorhandensein von
Sauerstoff und Verbrauch von ATP ein Substrat (z.B. Luciferin) in einer Lichtreaktion
umsetzt. Der Nachteil dabei ist, dass dieses Enzym um leuchten zu können sowohl
Sauerstoff braucht (deshalb kann es in anaeroben Bakterien evtl. schlecht eingesetzt
werden) als auch Energie in Form von ATP und das entsprechende Substrat (was des
Stoffwechsel der Zelle belastet bzw. eventuell extra dazugegeben werden muss).
Welche Voraussetzungen für homologe Rekombination kennen Sie?
Homologe Rekombination kann normalerweise nur stattfinden, wenn die beiden zu
rekombinierenden Sequenzen ausreichend große Komplementarität aufweisen. Nur bei
ausreichend großer Sequenzähnlichkeit dann können sich die homologen Stränge der
Nicht-Schwesterchromatiden paaren, um die Rekombination zu ermöglichen. Dafür
müssen die homologen Chromosomen auch nebeneinander angeordnet sein, sodass
homologe Abschnitte miteinander paaren können.
Welche Modelle zur homologen Rekombination kennen Sie?
Es gibt das Holliday-Modell, bei dem die Doppelstränge ein Rekombinationkreuz bilden,
welches sich durch Isomerisierung umlagern kann. Dabei wird entweder ein Teil eines
Einzelstrangs oder der Doppelstrang von einem Chromatiden auf einen anderen
übertragen werden.
Das Meselson/Radding-Modell beschreibt das Eindringen eines Einzelstrangs um einen
der Stränge im Nicht-Schwesterchromatid zu ersetzen. Der ersetzte Einzelstrang ersetzt
dann den zuerst eindringenden Einzelstrang.
Das Modell nach Szostak und Stahl besdchreibt, wie ein Doppelstrangbruch repariert
werden kann. Dafür ersetzt einer der überhängend abgebrochenen Einzelstränge einen der
Stränge des unbeschädigten homologen Doppelstrangs und kann somit aufgrund des
homologen Einzelstrangs über die Bruchstelle hinaus verlängert werden. Der abgelöste
Template-Strang ermöglicht währenddessen eine Verlängerung der anderen Seite der
Bruchstelle.
Was ist illegitime Rekombination?
Hierbei handelt es sich vermutlich um Rekombination zwischen nicht-homologen Stellen
im Genom. Hierbei kann die Rekombination auf dem selben Chromosom aber um einige Basen versetzt vorkommen oder zwei völlig verschiedene Teile des Genoms können
miteinander rekombinieren.
Warum besitzen praktisch alle Organismen Rekombinationssysteme?
Da diese essentiell sind für DNA-Reparatur.
Warum codieren manche Phagen ihr eigenes Rekombinationssystem und verlassen
sich nicht auf ihre Wirte?
Möglicherweise arbeiten die Rekombinationssysteme der Wirtszellen für die Phagen nicht
schnell genug. Rekombinationen kommen wahrscheinlich nicht oft genug vor, sodass es
für den Phagen zu unsicher wäre, sich für die Integration in ein Wirtsgenom auf dessen
Rekombinationssystem zu verlassen. Stattdessen codieren Phagen ihr eigenes System, um
unabhängig vom Wirt die Rekombination die für sie nötig ist zu gewährleisten.
Nennen Sie Namen und Funktion der an Rekombinationsvorgängen beteiligten
Enzyme!
RecA: Ist eine ATPase die RecBCD mit Energie versorgt und den Einzelstrang davon
abhält, gleich wieder mit dem jeweiligen Gegenstrang zu hybridisieren. Dadurch wird
stattdessen eine Hybridisierung mit dem Gegenstrang der homologen Region ermöglicht.
RecBCD: bilden einein Komplex der 3’-5’-Exonucleaseaktivität hat und anfängt einen
Einzelstrang bis zur χ-Site abbaut. Dort angekommen, wird die 5’-3’-
Endonucleaseaktivität des Komplexes wirksam, der den Gegenstrang angreift und abbaut.
Das freie 3’-Ende des zuerst angegriffenen Einzelstrangs kann dann in den Gegenstrang
eindringen und den ursprünglich vorhandenen Strang ersetzen.
RuvA: Stabilisiert als Tetramer die Ausbildung des Rekombinationskreuzes (also der
Holliday Junction)
RuvB: Ermöglicht die Migration des Rekombinationsreuzes in eine Richtung
RuvC: Schneidet zwei der vier miteinander wechselwirkenden DNA-Stränge in einem
Rekombinationskreuz und öst es dadurch wieder in zwei Doppelstränge auf.
Was haben Replikation, Rekombination und Reparatur gemeinsam?
Bei allen drei Vorgängen wird die jeweilige komplementäre DNA anhand eines Templates
erstellt.
- es sind Enzyme betiligt
- es sind Proteine beteiligt
- bei Replikation, Rekombination, Reparatur muss die DNS als Einzelstrang vorliegen
- Replikation, Reparatur laufen zum Teil Hand in Hand
- Alle drei Prozesse spielen sich an der DNS ab
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