Molbio der Pflanzen

Vorwärtsgenetik ist ein molekulargenetischer Ansatz zur Bestimmung der genetischen Basis, die für einen Phänotyp verantwortlich ist. Vorwärtsgenetische Methoden beginnen mit der Identifizierung eines Phänotyps und finden oder erstellen Modellorganismen, die das untersuchte Merkmal aufweisen.

Dabei kann eine Mutantenanalyse durchgefuehrt werden, z.B. durch EMS (chemische Mutagenese), durch die man jedes Gen, welches Mutationgenetyp vorweist, bestimmen kann.

• Forward Genetics geht vom Phaenotyp zum Genotyp
• Reverse Genetics: Man kennt den Genotyp kann ihm aber keinen Phaenotyp zuordnen.

HY5: ist benoetigt fuer das korrekte Lichtverhalten (photomorphogenesis), also die Entwicklung von offenen Catalydons und der Unterdrueckung von Entwicklung des Hypocotyls im Embryo.

COP1: wird fuer das korrekte Dunkelheitsverhalten benoetigt, also unterdrueckt es die lichtabhaengige Entwicklung der Pflanze => negativ Regulator der Photomorphogenesis

COP1 inaktiviert und degradiert HY5 bei Dunkelheit (im Nukleus). Bei Licht wird COP1 zur Cytoplasma transportiert, so dass HY5 exprimiert werden kann. In Cytoplasma wird COP1 durch Photorezeptoren und Kinasen inaktiviert.

Lichtverhalten von Arabidopsis-Samen:

• offene Cotyledons
• kurze Hypocotyl
• lange Wurzeln

bei mutante hy5: geschlossene Cotyledons, lange Hypocotyl, kleine Wurzeln

Dunkelverhalten von Arabidopsis-Samen:

• geschlossene Cotyledons
• lange Hypocotyl
• kurze Wurzeln

bei mutante cop1: offene Cotyledons, kurze Hypocotyl, lange Wurzeln

Es ist fuer die Entwicklung der Wurzel zustaendig.

GNOM: Fuehrt zu assymetrischer Zelldivision -> Unterteilung in basale Zelle (spaeter Nabelschnur) und apikale Zelle (spaeter Embryo).

Bei gnom (Mutante) ist die erste Zelldivision symmetrisch, das fuehrt zu fehlender Zellpolaritaet. Die Pflanze verliert alles und sieht im extremen Fall wie ein Ball aus.

ESTs sind kurze DNA-Sequenzen von meist 100–800 Basenpaaren Länge, die durch die teilweise Sequenzierung von cDNAs von deren 5'- oder 3'-Ende ausgehend gewonnen werden. Da cDNAs durch die reverse Transkription von mRNA erzeugt werden, stellen ESTs also einen Ausschnitt der Sequenz von Genen dar, die im betrachteten Lebewesen, Gewebe oder Zelltyp exprimiert werden, also aktiv sind. ESTs sind dabei im Vergleich zu Komplett-cDNA-Sequenzen oder Genomsequenzierungen mit relativ geringem Aufwand erzeugbar. Die gewonnenen Sequenzinformationen können anschließend in eine EST-Datenbank eingespeist werden und mittels Sequenzvergleichen und bioinformatischer Methoden als Grundlage weiterer Analysen dienen.

Genkarte:= die lineare Anordnung der Gene im Genom

• Auf einer genetischen Karte ist die relative Reihenfolge von Genorten eingetragen, die ueber die Kopplung zweier Gene und Rekombinationsfrequenzen bestimmt werden (Einheit: cM: 1 cM bedeutet eine Rekombinationshaeufigkeit von 1% => je weniger haeufig sich die Gene rekombinieren, desto naeher liegen die untersuchten Genorte beieinander. Bei einem Abstand von 50 cM gelten die Gene als ungekoppelt, d.h. man kann mittels Kopplungsanalysen nicht mehr feststellen, ob 2 Gene auf einem Chromosom liegen oder nicht. Die Gene gelten als gekoppelt, wenn (RF)<50%/50 cM).
• Auf einer physikalischen Genkarte sind die genauen Abstaende zw. Genen gemessen in Basenpaaren eingetragen.

=> wie oft die Gene rekombiniert werden (je mehr Rekombination desto mehr liegen die Gene weit auseinander)

RF = Anzahl der rekombinanten Individueen/Anzahl der Gameten

=> sind eindeutig identifizierbare, kurze DNA-Abschnitte, deren Ort im Genom bekannt ist, z.B. SNPs.

-> sich wiederholende, zwischen den Genen liegende DNA Sequenz, die sich in ihrer Laenge zwischen Individuuen Untetrscheiden. Ensteheung siehe Bild:

BAC (bacterial artificial chromosome) ist ein kuenstliches Chromosom, wobei ein zu untersuchende DNA-Abschnitt in ein F-Plasmid eingebaut wurde und zur Replikation in E. coli engebracht wird.

• stabil
• kann bis zu 300 kbp lange Fragmente klonen
• kann zur Genomsequenzierung genutzt werden

• Shotgun Sequencing: Hierbei wird die DNA zunächst zufällig fragmentiert und die resultierenden Fragmente anschließend sequenziert. Nun koennen mit Hilfe eines Computers die Ueberlappungen (Paired end Reads) erkannt werden und so kann die Gesamtsequenz bestimmt werden.

Vorteil: keine physikalische Genkarte wird benoetigt.

Nachteil: grosse Luecken zw. Sequenzen und es koennen Probleme mit den repetitiven Seqeunzen auftreten

• Ordered Clone Sequencing: Es wird eine physikalische Karte der Klone in dem Genom erstellt, d. h., die Reihenfolge und die Orientierung der Sequenzen der Clone wird durch Untersuchung auf genetische Marker ermittelt (physical mapping). Dabei wird das Genom mit Restriktionsenzymen in mehrere überlappende Bereiche geschnitten. Diese werden in BACs reingetan und kloniert. BACs, die bei minimaler Überlappung ausreichen, um ein Contig abzudecken werden einzeln schrotschuss-sequenziert (minimal tiling path) und mit Hilfe der physikalischen Karte kann eine komplette Konsensussequenz abgeleitet werden. 

• Start- und Stoppcodons
• kodierende Sequenzen (CDS sind Exons)
• 3' und 5' UTR (diese sind auch in cDNA zu finden)
• Intergenic Regionen (zw. Genen)

Strukturelle Annotation, die rein auf der Sequenz basiert, ist nur 30% genau. Deswegen ist es hilfreich Experimante herbeizuziehen wie z.B ESTs oder Protein.

Fuer die funktionelle Annotation werden die bekannte Proteinseqeunzen, die eine bekannte Funktion haben, mit dem zu untersuchenden Protein verglichen.

Wenn 2 Proteine gleiche konservierte Domaenen haben, dann es ist auch wahrscheinlich, dass sie die gleiche Struktur und die Funktion haben (Domaen-basierte Proteomvergleiche).

Fuer die Klassifizierung der Gene wird die Gene Ontology (GO) verwendet. GO ist eine biomedizinische Ontologie, die fuenf Bereiche abdeckt: „Zelluläre Komponente“, „Biologischer Prozess“, "Wachstum und Entwocklungsstadien", "Pflanzenstruktur" und „Molekulare Funktion“. Jeder Terminus besteht aus einem Namen, einer Nummer und assoziierten Daten.

Chromatin ist das Material, aus dem die Chromosomen bestehen. Es handelt sich um einen Komplex aus DNA und speziellen Proteinen, von denen wiederum etwa die Hälfte Histone sind.

Einheit: Nukleosom, die aus DNA gewickelt um Histonen entsteht.

Euchromatin: chromosomale Material, das genetisch aktiv ist.

Heterochromatin: eng gewickelte Nukleosome, die genetisch inaktiv sind.

=> ist das Fachgebiet der Biologie, das sich mit der Frage befasst, welche Faktoren die Aktivität eines Gens und damit die Entwicklung der Zelle zeitweilig festlegen.

Ein epigenetisches Merkmal ist ein stabil vererbbarer Phänotyp, der aus Veränderungen in einem Chromosom ohne Veränderungen der DNA-Sequenz resultiert.

ENCODE ist ein Forschungsprojekt. Ziel des Projekts ist, alle funktionellen Elemente des menschlichen Genoms sowie das Transkriptom zu identifizieren und zu charakterisieren.

Es widmet sich der Bestimmung der Rolle der verbleibenden Komponente des Genoms, die traditionell als „Junk“ bezeichnet wird. Dabei wird alles als "funktionell" bezeichnet, das transkribiert wird. Dies wird oft als eine sehr liberale Definition von "funktionell" kritisiert.

Diese Definition stimmt aber nicht unbedingt, da z.B. Pseudogene gibt, die transkribiert werden, aber trotzdem keine Funktion haben.

Domaene:= Eine Proteindomäne ist eine unabhängige Struktureinheit, von der erwartet wird, dass sie sich zu einer globulären Domäne faltet. Sie hat ohne Fragmentierung die Evolution durchlaufen.

Proteinklasse:= Eine Proteinfamilie ist eine Gruppe evolutionär verwandter Proteine, die eine oder mehrere Domänen teilen können.

• Knock-out and/or overexpressor
• Expression-transcriptional profiling
• Intracellular localization
• Regulation of transcription, splicing or translation
• Post translational modifications
• Protein protein interactions
• Structural analyses

Unter Gen-Knockout wird das vollständige Abschalten eines Gens im Genom eines Organismus verstanden.

Methoden:

• Gendeletionen mittels homologe Rekombination
• Genunterbrechung (gene disruption) mittels T-DNA-Insertionen und Transposons
• RNAi (mRNA inhibition)
• Punktmutationen

1. Homologe Gene, die die gleiche Funktion ausueben.
2. Stumme Mutation (codiert fuer gleiche oder aehnliche Aminosaeure). Funktion aendert sich nicht, da der Proteinstruktur gleich bleibt.

• Einzigartige Gene, die keine Kopie haben (30% des Genoms)
• Molekulare Schalter, die eine grosse Anzahl an Genen kontrolieren (z.B. Transkriptionsfaktoren)

Proteine, die auf die Peroxisomen, Mitochondrien, Plastiden und den Zellkern gerichtet sind, werden an freien Ribosomen im Zytosol synthetisiert und mittels spezifischer Signalsequenzen angesteuert, die auf den Proteinen selbst liegen.

Proteine, die für die Vakuole, die Plasmamembran, die Zellwand oder das Apoplasma bestimmt sind, werden im Lumen des ER synthetisiert. Vom ER gelangen die Proteine in den sekretorischen Weg , ein intrazelluläres System aus Vesikeln und Zisternen.

1. ER synthetisiert Proteine, die in den sekretorischen Weg eintreten, verarbeitet und sortiert sie auch, fügt Proteine Glykane hinzu und synthetisiert verschiedene Lipidmoleküle
2. Golgi-Apparat besteht aus dem Komplement der Golgi-Stapel und dem Trans-Golgi-Netzwerk. Es erhält neu synthetisierte Lipide und Proteine aus dem ER. Es ist auch eine Kohlenhydratfabrik, denn: Sie baut komplexe (verzweigte) Polysaccharide der Zellwand wie Pektine und Xyloglucane zusammen. Sie synthetisiert die Oligosaccharid-Seitenketten der Glykoproteine im sekretorischen Weg.  Sie produziert Glykolipide für Plasmamembran und Tonoplasten (= Membran, das das pflanzliche Vakuole umgibt).
3. TGN fungiert als ein Zentrum im Informationsfluss zur und von der Plasmamembran.

1. Budding: Ein Vesikel knospt von einer Spendermembran.
2. Delivery: Das Vesikel wird an eine Zielmembran abgegeben.
3. Tethering: Das Vesikel ist an einen Akzeptor oder eine Zielmembran mittels eines Anbindemoleküls oder -komplexes gebunden.
4. Docking: Das angebundene Vesikel wird fest angedockt, wenn der V- und t-SNAREs-Reißverschluss einen SNARE-Pin bildet. Dies wird als trans-SNARE-Komplex bezeichnet, da sich die SNAREs auf verschiedenen Membranen befinden.
5. Fusion: Die Vesikel- und Zielmembranen verschmelzen, wodurch der Vesikelinhalt (cargo) an das Zielkompartiment abgegeben wird. Der SNARE-Komplex wird jetzt als cis-SNARE-Komplex bezeichnet, da die Vesikelmembran nun an die Zielmembran angrenzt.
6. Recycling: Die t- und v-SNAREs werden jetzt recycelt. Dies bedeutet, dass der enge Komplex aufgebrochen werden muss, und dies geschieht aufgrund des NSF-ATPase/SNAP-Komplexes, wobei NSF für NEM-sensitives Fusionsprotein steht und eine AAA-ATPase ist.

1. Spezifitaet:

• Cargo-Selektion mittels ARF GTPasen bei "Budding"
• Anbinden der Vesikeln an Zielmembran mittels Rab GTPase und Anbindemolekuele (Tethering factors) bei "Tethering"
• Theorie der "cognate" SNAREs => ein gegebenes v-SNARE kann nur mit einer bestimmten Menge von t-SNAREs einen Komplex bilden bei "Fusion"

2. Geschwindigkeit:

Die Geschwindigkeit bei Membrane Traffic wird erreicht, indem der Prozess der Vesikelfusion bis zur Andockphase eingestellt wird und dann das Fusionsereignis zur richtigen Zeit am richtigen Ort durch Entfernen von CLAMP ausgelöst wird.

• Synaptotagmin (CLAMP; Repressor der Membranfusion) wird durch Calcium (Trigger) inaktiviert, wodurch die Membranfusion stattfinden kann.

SNAREs sind Coiled-Coil-Membranproteine mit einem hochkonservierten SNARE-Motiv aus 60 Aminosäuren neben dem Membrananker. Sie vermitteln in der Zelle die Fusion von Vesikeln untereinander oder mit der Zellmembran.

SNAREs are noetig und ausreichend um die Membranfusion zu ermoeglichen. Es wurde beispielsweise festgestellt, dass tierische Zellen, die die interagierenden Domänen von v- und t-SNAREs auf der Zelloberfläche exprimieren, spontan fusionieren.

Sec1-Proteine werden für die Bildung von SNARE--pin und die Membranfusion benötigt. Wenn sich SNARE-Moleküle paaren, bilden sie ein Vier-Helix-Bündel, wobei eine Helix von einem v-SNARE, eine von einem t-SNARE und zwei zusätzliche Helices von einem als SNAP25 bezeichneten Protein bereitgestellt wird.

Aktuelle Modelle postulieren, dass die freigesetzte freie Energie verwendet wird, um Doppelschichten zu verschmelzen, wenn sich ungefaltete SNARE-Proteine zu einem Vier-Helix-Bündel falten. Mit anderen Worten, die Proteinfaltung ist thermodynamisch an die Membranfusion gekoppelt.

• Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Formation der beschichteten Vesikeln (mit den Huellproteinen).
• Sie sind kleine GTP-bindende Proteine (aktive Form: GTP gebunden und inaktiv: GDP gebunden). Aktive Formen rekrutieren Huellproteine und fangen Cargo ein.
• ARF GTPasen spielen eine wichtige Rolle bei der Sortierung, Vesikelformation.
• Cargo-Erkennung geschieht durch Rezeptoren und die Formation der Vesikeln sowie Membrankruemmung geschieht durch die Huellproteine

ARF-GDP wird zur ARF-GTP gewandelt (durch die ARF-GEFs).

GEF: Der Austausch von GDP gegen Triphosphatnukleotid wird durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) vermittelt.

GAP: Umgekehrt wird die Hydrolyse von gebundenem GTP durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) vermittelt.

• Zielmembran besitzt Anbindefaktoren wie lange coiled-coil Proteine oder grosse Mehruntereinheitkomplexe.
• Vesikel besitzt Rab GTPasen => binden Anbindefaktoren an Zielmembran, wenn sie GTP gebunden sind (also aktiv);

• GNOM befindet sich auf Recycling-Endosomen
• GNOM codiert fuer ARF-GEF

1. Zuerst wird das Ubiquitin durch E1 (Ubiquitin aktivierendes Enzym) aktiviert. Dafuer wird ATP gebraucht.
2.  Ubiquitin wird dann von E1 zur E2 transferiert (E2: Ubiquitin konjugierendes Enzym).
3.  Es wird eine Isopeptid-Bindung mithilfe von E3 (Ubiquitin Proteinligase) zwischen Zielprotein und Ubiquitin hergestellt.

Subtratspezifitaet: Substratprotein (Zielprotein) wirdd durch E3 erkannt.

• 26S Proteasome: 2 19S Lid & 1 20S Core
• Obere 19S Lid erkennt ubiquitinierte Proteine und transportiert diese zum Core.
• 20S Core deubiquitiniert, entfaltet und degradiert die Proteine.
• Untere 19S Lid gibt die degradierte Proteinstuecke frei.

• HY5 ist ein Transkriptionsfaktor, der sich immer im Nukleus befindet.
• COP1 aendert seine Lokation abhaenging von der Licht. Er ist im Nukleus bei Dunkel und im Cytoplasma bei Licht.
• COP1 hat ein RING-Finger-Domaene, der an E2 bindet, ein NIS (Nuklear-Inport-Sequenz) und NES (Nuklear Export Sequenz), sowie WD40 repeats, die fuer die Interaktiven mit Subtrate und Photorezeptoren sorgen. 
• Gene, die von COP1 unterreguliert werden, werden normalerweise hochreguliert durch HY5.

COP1 ubiquitiniert HY5, damit es degradiert wird und seine Funktion nicht ausuebt. Im Dunkel deaktiviert und degradiert COP1 die HY5 im Nukleus, so dass die korrekte Dunkelverhalten ausgeuebt wird. (COP1 degradiert auch Photorezeptoren bei Dunkelheit). Bei Licht wird COP1 zur Cytoplasma transportiert, so dass es nicht HY5 deaktiviert und HY5 exprimiert werden kann. COP1 wird durch aktive Photorezeptoren und Kinasen im Cytoplasma inaktiviert.