Molekulare Genetik und Regulationsphysiologie der Tiere

Restriktionsendonukleasen. Sie sind Enyme die die DNA an bestimmten Positionen erkennen und schneiden. Sie sind eingentlich ein Abwehrmechanismus von Bakterien gegen virale Fremd DNA, werden jedoch oft in der molekularen Klonierung eingesetzt.

Meistens haven sie eine palindromische Erkennungssequenz. Sie schneiden entweder mit Überhang (sticky ends, einfacher zu handhaben) oder glatt (blunt ends).

Restriktionsenzyme schneiden Überhänge, sodass die beiden DNA Stränge nicht zusammenpassen. Um die beiden Stränge aneinander anzupassen, syntetisiert man einen Doppelstrang am 5' Überhang in 5' -> 3' Richtung mit der T4 Polymerase und baut den 3' Überhang des längeren Strangs in 3' -> 5' Richtung mit Hilfe des Klenow Fragmentes ab. Man erhält also zwei gleich lange komplementäre DNA Stränge.

Feststellen der Kopienanzahl der Plasmid Integration.

1. DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen -> Laden auf Agarosegel -> Auftrennung nach Länge
2. Übertragen auf Membran (oft durch Kapillarkräfte bzw. Wassersog mit Filterpapier)
3. Nachweis über Sonde (z.B radioaktive Isotope) mit Röntgenkassete

Nachteil: Isotope kleiner als 1kB und größer als 10kB verschminnen an den jeweiligen Grenzen

Vorteil: Fragmentlänge egal, absolute Quantifizierung möglich, d.h es lässt sich die Anzahl der DNA Fragment Kopien in einer Zelle feststellen.

Zunächst wird eine normale PCR durchgeführt (forward + reverse Primer + Amplifikation). Zusätzlich bindet jedoch eine Sonde an die amplifizierten DNA Fragmente, welche fluoreszensmarkiert ist und einen oder zwei Quencher besitzt. Der Quencher nimmt die fluoreszenz des Farbstoffes auf und gibt sie bei einer anderen Wellenlägne wieder zurück. Wird die Sonde jedoch geschnitten oder zerstört so kommt es zu einer Emission auf eine anderen spezifischen Wellenlänge die detektiert werden kann.

Bei der PCR wird eine Polymerase verwendet die eine Exonnuklease Aktivität besitzt und den Quencher bei der Amplifikation abschneidet. Unser Fragment leuchtet also wenn eine Amplifikation stattgefunden hat. Um eine absolute Quantifizierung durchzuführen wird der Reaktionsansatz in ganz kleine Tropfen aufgeteilt (ca. 20.000). In der Praxis befindet sich im Tropfen meist nur ein einzelnes DNA Molekül. In den einzelen Tropfen läuft PCR ab und die Tropfen leuchten grün. Diese Tropfen lassen sich detektieren und auszählen.

Für die absolute Quantifizierung benötigt man ein zweites Referenzgen, z.B GAPDH, welches über eine andere Sonde detektiert wird. Da wir wissen wie viele Kopien GAPDH in der Zelle vorhanden sind, kann darüber bestimmt werden wie viele Kopien in der Zelle tatsächlich vorliegen.

Ziel: Detektion von Proteinen.

Vorgehen:

1. Laden und seperieren der Proteinproben mit SDS Page
2. Transfer des Proteins auf eine PDVF Membran
3. Blocken der unspezifischen Wechselwirkungen durch neutral Proteine wie BSA oder Casein
4. Spezifische Antikörper binden an das Target Protein
5. Antikörper sind entweder gelabelt mit HRP (teuer) oder man verwendet sekundäre Antikörper die eine vielzahl an primären Antikörpern erkennen (billiger)
6. Abbildung bei auf der unterschiedlich Größenfragmente erkennbar sind.

Heutzutage wird erher die RT-PCR zur Feststellung der Proteinaktivität verwendet.

• Expression mit LacZ Gen Marker -> Blau Weiß Selektion (ß-Galaktosidas setzt X-Gal zu blauem Farbstoff um, wenn jedoch Insert in LacZ Gen dann bleiben Bakterien weiß)
• Expression von fluoreszenten Proteinen (z.B), Untersuchung mit dem Fluoreszenmikroskop + Hellfeldaufnahme