Molekulare Genetik und Regulationsphysiologie der Tiere

Restriktionsenzyme schneiden Überhänge, sodass die beiden DNA Stränge nicht zusammenpassen. Um die beiden Stränge aneinander anzupassen, syntetisiert man einen Doppelstrang am 5' Überhang in 5' -> 3' Richtung mit der T4 Polymerase und baut den 3' Überhang des längeren Strangs in 3' -> 5' Richtung mit Hilfe des Klenow Fragmentes ab. Man erhält also zwei gleich lange komplementäre DNA Stränge.

Feststellen der Kopienanzahl der Plasmid Integration.

1. DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen -> Laden auf Agarosegel -> Auftrennung nach Länge
2. Übertragen auf Membran (oft durch Kapillarkräfte bzw. Wassersog mit Filterpapier)
3. Nachweis über Sonde (z.B radioaktive Isotope) mit Röntgenkassete

Nachteil: Isotope kleiner als 1kB und größer als 10kB verschminnen an den jeweiligen Grenzen

Vorteil: Fragmentlänge egal, absolute Quantifizierung möglich, d.h es lässt sich die Anzahl der DNA Fragment Kopien in einer Zelle feststellen.

Zunächst wird eine normale PCR durchgeführt (forward + reverse Primer + Amplifikation). Zusätzlich bindet jedoch eine Sonde an die amplifizierten DNA Fragmente, welche fluoreszensmarkiert ist und einen oder zwei Quencher besitzt. Der Quencher nimmt die fluoreszenz des Farbstoffes auf und gibt sie bei einer anderen Wellenlägne wieder zurück. Wird die Sonde jedoch geschnitten oder zerstört so kommt es zu einer Emission auf eine anderen spezifischen Wellenlänge die detektiert werden kann.

Bei der PCR wird eine Polymerase verwendet die eine Exonnuklease Aktivität besitzt und den Quencher bei der Amplifikation abschneidet. Unser Fragment leuchtet also wenn eine Amplifikation stattgefunden hat. Um eine absolute Quantifizierung durchzuführen wird der Reaktionsansatz in ganz kleine Tropfen aufgeteilt (ca. 20.000). In der Praxis befindet sich im Tropfen meist nur ein einzelnes DNA Molekül. In den einzelen Tropfen läuft PCR ab und die Tropfen leuchten grün. Diese Tropfen lassen sich detektieren und auszählen.

Für die absolute Quantifizierung benötigt man ein zweites Referenzgen, z.B GAPDH, welches über eine andere Sonde detektiert wird. Da wir wissen wie viele Kopien GAPDH in der Zelle vorhanden sind, kann darüber bestimmt werden wie viele Kopien in der Zelle tatsächlich vorliegen.

Ziel: Detektion von Proteinen.

Vorgehen:

1. Laden und seperieren der Proteinproben mit SDS Page
2. Transfer des Proteins auf eine PDVF Membran
3. Blocken der unspezifischen Wechselwirkungen durch neutral Proteine wie BSA oder Casein
4. Spezifische Antikörper binden an das Target Protein
5. Antikörper sind entweder gelabelt mit HRP (teuer) oder man verwendet sekundäre Antikörper die eine vielzahl an primären Antikörpern erkennen (billiger)
6. Abbildung bei auf der unterschiedlich Größenfragmente erkennbar sind.

Heutzutage wird erher die RT-PCR zur Feststellung der Proteinaktivität verwendet.

• Expression mit LacZ Gen Marker -> Blau Weiß Selektion (ß-Galaktosidas setzt X-Gal zu blauem Farbstoff um, wenn jedoch Insert in LacZ Gen dann bleiben Bakterien weiß)
• Expression von fluoreszenten Proteinen (z.B), Untersuchung mit dem Fluoreszenmikroskop + Hellfeldaufnahme

Zunächst erfolgt der Restriktionsverdau (z.B mit EcoR I), welches zum Beispiel im LacZ Gen schneidet (dies ist für die spätere Selektion wichtig). Die eigentliche Ligation (d.h einfügen des DNA fragements in die DNA) erfolgt über das Enzym Ligase, welche die Sticky Ends zusammenfügt. Nun kann über Blau Weiß Selektionen überprüft werden bei welchen Bakterien der Insert erfolgreich war. Die weißen Bakterien haben ein Insert in ihrem LacZ Gen. Dies ist eine Art Vorselektion, da noch nicht festgestellt werden kann ob auch das korrekte Insert eingefügt wurde. Daher kann danach noch ein Southern Blot oder eine ddPCR durchgeführt werden.

2 Möglichkeiten

1. Chemische Transformation (Hitzeschock)
2. Elektroporation (elektrischer Schock)

Anschließend kann man die Bakterien mit dem Plasmid über Antibiotikaresistenzen oder über X-Gal auf einer Agar Platte selektieren.

Bestandteile

• Restriktionsschnittstellen/Multiple Cloning Site (Für Verdau und Ligation)
• Origin of Replication (Damit Bakterium das Plasmid vermehren kann)
• Antibiotikaresitenz (Für Selektion)

Plasmid auf dem Gel

• Ungeschnitten: Nicked und Supercoiled (2 Banden) Supercoiled läuft weiter
• Geschnitten verdaut: Nur eine Bande, linear

Denaturierung:

• Durch Erhitzen (94-98°) werden die Wasserstoffbrücken zwischen den DNA Strängen gelöst und man erhält einzelne DNA Stränge

Anealing:

• Die Temperatur wird auf 50-65°C gesenkt. Dies erlaubt das binden der beiden Primer an die jeweiligen DNA Stränge

Extension/Elongation

• Die DNA Polymerase verlängert die jeweiligen Primer sodass sich wieder Doppelsträngige DNA bildet.

Der Prozess kann nun erneut beginenn, dies führt zu exponentieller Vervielfältigung der DNA.