Molekularbiologie
Molekularbiologische Methoden
Molekularbiologische Methoden
Set of flashcards Details
| Flashcards | 25 |
|---|---|
| Language | Deutsch |
| Category | Biology |
| Level | Other |
| Created / Updated | 13.03.2019 / 08.10.2019 |
| Weblink |
https://card2brain.ch/box/20190313_molekularbiologie_ie
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Was sind Restriktionsenzyme?
Sind kleine Proteine, die spezielle DNA-Sequenzen erkennen und dort gezielt schneiden.
Werden in der Analytik für DNA-Analysen benutzt. Diese werden mittels Restriktionsenzyme in ein bestimmtes Fragment Muster überführt. -Relativ günstig und schnell.
MERKE:
-In der Molekularbiologie zum klonieren von DNA-Sequenzabschnitten in Vektoren.
-Zur Unterscheidung von verschieden Bakterienarten (RFLP)
Warum sind Restriktionsenzyme ''Palindrom'' ?
(ein Palindrom ist ein Wort, Vers oder Satz, der sich vorwärts wie rückwärts gleich liest z.B. SUGUS
Erkennungssequenz kreuzweise spiegelbildlich angeordnet, was als Palindrom bezeichnet wird.
Welche zwei Arten von Restriktionsenzymen gibt es?
1) sticky ends: zu deutsch klebrige Enden. Gemeint sind die überstehenden, einzelsträngigen Bereiche mit ungepaarten Basen. Beispiel: EcoRI erzeugt 3'‐ Überhänge, PstI ergibt einen 5'‐Überhang.
2) blunt ends: zu deutsch stumpfe Enden. Wie schon der Name sagt, haben die Enden keinen Überhang aus ungepaarten Basen. Beispiel: SmaI schneidet blunt end.
Was ist RLFP?
Restriktions‐Fragment‐Längen‐Polymorphismus :
-ist eine Technik, bei der Organismen aufgrund ihrer unterschiedlichen DNA‐Sequenz und demzufolge unterschiedlicher DNA‐Schnittmuster unterschieden werden.
-eine Methode, zur Ermittlung des genetischen Fingerabdruckes.
Was ist die ''Funktion' von PCR?'
Braucht es grosse DNA-Mängen?
Mit der Polymerase Chain Reaction (PCR, Polymerase Kettenreaktion) lässt sich im Reagenzglas ein gewünschter DNA‐Abschnitt äusserst selektiv um den Faktor 106 bis 109 vermehren.
Als Vorlage reichen kleinste DNA‐Mengen, die zudem nicht besonders rein sein müssen.
Welche drei Schritte bei der PCR?
(Temp. kennen!)
1)Denaturierung:
-Durch erhitzen werden die beiden DNA-Stränge aufgetrennt.
-94° C
2)Annealing:
Hier wird ermittelt welcher Bereich amplifiziert werden soll -> durch Bindung der Primer
-Primer werden verwendet
-Temp. Wird gesenkt (zum Tm -Wert/Schmelzwert)
-Tm-Wert wird ausgenutzt
-Wichtig-> Primer 1&2 müssen die gleiche Tm haben
3)DNA-Synthese (Elongation):
-Wie bei der normalen DNA-Replikation wird dabei der Einzelstrang mithilfe von der Polymerase und den Nukleotiden zu einem Doppelstrang ergänzt.
-72° C
Welche fünf sachen wird für die PCR benötigt?
1) DNA‐Template (Vorlage)
2) Primer 1 und Primer 2
3) Desoxynucleotidtriphosphate (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) als Bausteine für die
herzustellenden DNA‐Fragmente
4)ein Puffer (mit MgCl2) stellt geeignete Arbeitsbedingungen für die Taq‐Polymerase sicher
5) Taq‐Polymerase für die Replikation der DNA
Was sind Primer?
Primer sind einzelsträngige, künstlich hergestellte, kleine DNA‐ Stücke mit einer Länge von 15 bis 30 Basen. Sie können mit je einem Strang der Vorlage paaren. Der Bereich dazwischen wird später amplifiziert.
MERKE:
Vorwärts/Rückwärts Primer benötigt!
Wie vile male wird der Zyklus bei der PCR wiederholt?
Was macht es so leistungsfähig?
-ca. 25 ‐ 35 Cyclen
Was die PCR‐Methode so leistungsfähig macht, ist die exponentielle Vermehrung des gewünschten DNA‐Fragments.
Wie wird ein Primer designt?
Forward primer
Reverse primer
Forward:
-kann übernommen werden
Reverse:
-Achtung: muss reverse komplementär ermittelt werden
Definition Gelelektrophorese
Mittels Gelelektrophorese lassen sich DNA‐Fragmente aufgrund ihrer Grösse trennen.Sie bildet eines der wichtigsten Verfahren im Umgang mit DNA.
Ablauf einer Gelelektrophorese
A) Das Gemisch an DNA‐Fragmenten wird in die Taschen in der Nähe der negativ geladenen Elektrode gegeben. Das Gel ist von einem Puffer umgeben, der den pH konstant hält und den Stromfluss ermöglicht.
B) Startsituation ‐ Durch Anlegen einer Spannung beginnen die DNA‐Moleküle in Richtung Anode zu wandern.
C) Am Ende sind die DNA‐Moleküle nach ihrer Grösse aufgetrennt. Je kleiner das Fragment, desto weiter ist es gewandert. DNA‐Fragmente mit identischen Längen bilden zusammen eine Bande, hier als schwarzer Balken dargestellt.
Durch Anlegen einer Spannung beginnen die DNA‐Moleküle in Richtung Anode zu wandern
-> wiso ist das möglich?
Die Phosphat‐Gruppen des Backbones verleihen den DNA‐Molekülen eine stark negative Ladung.
Phasphatgruppe ist negativ geladen
Aus was besteht das Trägermaterial bei er Gelelektrophorese meistens?
Als Trägermaterial wird meist das Polysaccharid Agarose verwendet.
Real Time PCR:
Was ist der Unterschied / Vorteil von qPCR gegenüber der normalen PCR?
durch welche drei Methoden ist dies Möglich?
-gebildetete DNA‐Menge können während der PCR im Tube gemessen werden
--> Amplifikation und Qantifizierung gleichzeitig
SYBR-Green-Markierung
Hybredisierung
Taq-Man Format
Real Time PCR:
SYBR-Green-Markierung:
Prinzip:
-SYBR-Green Substanz bindet an alle doppelsträngigen DNA
-durch die Bindung Fluoresziert die Substanz etwa 100x Stärker als ungebunden
-diese Fluereszenz kann gemessen werden
Nicht SPEZIFISCH
Real Time PCR:
Hybridisierung:
Prinzip:
-zwei sonden binden während Annealing-Phase spezifisch an ziel-DNA
-eine sonde trägt einen Donor, der andere einen Akzeptor
-das angeregte Donor-Molekül überträgt seine Energie auf das sich in seiner Nähe befindende Akzeptor-Molekül
-Fluoresziert (Rot)
-Polymerase löst diese Sonden ab (Während DNA-Synthese)
-am Ende des Annealing wird die Fluoreszenz gemessen
= Die gemessene Fluoreszenz ist direkt proportional zur DNA-Konzentration
SPEZIFISCH
Real Time PCR:
Taq-Man-Format:
Prinzip:
-Sonde mit zwei Molekülen : Reporter & Quencher
-Quencher unterdrückt die Fluoreszenz des Reporters
-Diese sonde bindet Spezifisch an DNA
-bei der DNA-Synthese baut die Polymerase diese sonde ab -> Fluoreszenz des Repoters nicht mehr unterdrückt = Fluoreszenz
SPEZIFISCH
Berechnung Tm-Wert
Berechnung Ta-Wert
Berechnung Tm-Wert :
Primer_forward: 14 x 2°C + 6 x 4°C = 52°C Primer_reverse: 16 x 2°C + 5 x 4°C = 52°C
Berechnung Ta-Wert :
Primer_forward: 52°C – 2°C = 50°C Primer_reverse: 52°C - 2°C = 50°C
MERKE:
Falls unterschiedliche Temp. muss es angepasst werden.
DNA - Sequenzierung - Kettenabbruchmethode
Was ist der ''Sinn''?
Mithilfe der DNA Sequenzierung kann die Basenabfolge eines DNA strangs ermittelt werden.
Welche sechs dinge würd für die DNA - Sequenzierung - Kettenabbruchmethode benötigt?
-dNTP's
-ddNTP's
-Polymerase
-Primer f oder R
-Puffer
-H2O
DNA - Sequenzierung - Kettenabbruchmethode
Was sind ddNTP's?
Was ist der Unterschied zu einem normalen dNTP?
ddNTP's haben am 3' C-Atom nur ein H und nicht ein OH
-> kann keine darauffolgenden basen mehr binden.
Ablauf DNA - Sequenzierung - Kettenabbruchmethode
https://www.youtube.com/watch?v=JcfnrJDTPG0
Kombi aus PCR, Gelelektrophorese und ddNTP's
-Polymersae fügt die Komplemeren Basen zu
-Bei einer modifizierten Base bricht sie ab (ddNTP)
-Durch diesen ''künstlichen'' Abbruch erhät man verschieden lange DNA-Stränge
-Diese verschieden Lange DNA-Stränge kann man mithilfe von einer Gelelektrophorese der grösse nach auftrennen
-> je kleiner umso früher
Westernblot:
Was wird wie Nachgewiesen?
Ist es spezifisch?
Proteinnachweis mithilfe Gelelektrophorese und AK
A
Proteine werden aufgetragen und nach Grösse aufgeteilt -> Gelelektrophorese
B
Mihilfe von Strom werden die Proteine auf eine Membran überführt -> Blotting
C
um die Proteine auf der Membran sichtbar zu machen, werden sehr Spezifische AK benutzt. Anschliessend wird ein Enzymmarkierter AK benützt, um die gebundenen Proteine sichtbar zu machen
D
Nun kann mithilfe der Grösse und der AK die Proteine nachgewiesen werden
Westernblott:
Die ________ der Aminosäure wird überdeckt
eigenladung
