Molekularbiologie

Erkennungssequenz kreuzweise spiegelbildlich angeordnet, was als Palindrom bezeichnet wird.

1) sticky ends: zu deutsch klebrige Enden. Gemeint sind die überstehenden, einzelsträngigen Bereiche mit ungepaarten Basen. Beispiel: EcoRI erzeugt 3'‐ Überhänge, PstI ergibt einen 5'‐Überhang.

2) blunt ends: zu deutsch stumpfe Enden. Wie schon der Name sagt, haben die Enden keinen Überhang aus ungepaarten Basen. Beispiel: SmaI schneidet blunt end.

Restriktions‐Fragment‐Längen‐Polymorphismus :

-ist eine Technik, bei der Organismen aufgrund ihrer unterschiedlichen DNA‐Sequenz und demzufolge unterschiedlicher DNA‐Schnittmuster unterschieden werden.
-eine Methode, zur Ermittlung des genetischen Fingerabdruckes.

Mit der Polymerase Chain Reaction (PCR, Polymerase Kettenreaktion) lässt sich im Reagenzglas ein gewünschter DNA‐Abschnitt äusserst selektiv um den Faktor 106 bis 109 vermehren.

Als Vorlage reichen kleinste DNA‐Mengen, die zudem nicht besonders rein sein müssen.

1)Denaturierung:
-Durch erhitzen werden die beiden DNA-Stränge aufgetrennt. 
-94° C

2)Annealing:
Hier wird ermittelt welcher Bereich amplifiziert werden soll -> durch Bindung der Primer
-Primer werden verwendet
-Temp. Wird gesenkt (zum Tm -Wert/Schmelzwert) 
-Tm-Wert wird ausgenutzt 
-Wichtig-> Primer 1&2 müssen die gleiche Tm haben

3)DNA-Synthese (Elongation): 
-Wie bei der normalen DNA-Replikation wird dabei der Einzelstrang mithilfe von der Polymerase und den Nukleotiden zu einem Doppelstrang ergänzt.
-72° C

1) DNA‐Template (Vorlage)

2) Primer 1 und Primer 2

3) Desoxynucleotidtriphosphate (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) als Bausteine für die

herzustellenden DNA‐Fragmente
4)ein Puffer (mit MgCl2) stellt geeignete Arbeitsbedingungen für die Taq‐Polymerase sicher

5) Taq‐Polymerase für die Replikation der DNA

Primer sind einzelsträngige, künstlich hergestellte, kleine DNA‐ Stücke mit einer Länge von 15 bis 30 Basen. Sie können mit je einem Strang der Vorlage paaren. Der Bereich dazwischen wird später amplifiziert.

MERKE:
Vorwärts/Rückwärts Primer benötigt!

-ca. 25 ‐ 35 Cyclen 

Was die PCR‐Methode so leistungsfähig macht, ist die exponentielle Vermehrung des gewünschten DNA‐Fragments.

Forward:
-kann übernommen werden

Reverse:
-Achtung: muss reverse komplementär ermittelt werden

Mittels Gelelektrophorese lassen sich DNA‐Fragmente aufgrund ihrer Grösse trennen.Sie bildet eines der wichtigsten Verfahren im Umgang mit DNA.

A) Das Gemisch an DNA‐Fragmenten wird in die Taschen in der Nähe der negativ geladenen Elektrode gegeben. Das Gel ist von einem Puffer umgeben, der den pH konstant hält und den Stromfluss ermöglicht.

B) Startsituation ‐ Durch Anlegen einer Spannung beginnen die DNA‐Moleküle in Richtung Anode zu wandern.

C) Am Ende sind die DNA‐Moleküle nach ihrer Grösse aufgetrennt. Je kleiner das Fragment, desto weiter ist es gewandert. DNA‐Fragmente mit identischen Längen bilden zusammen eine Bande, hier als schwarzer Balken dargestellt.

Die Phosphat‐Gruppen des Backbones verleihen den DNA‐Molekülen eine stark negative Ladung.

Phasphatgruppe ist negativ geladen

Als Trägermaterial wird meist das Polysaccharid Agarose verwendet.

-gebildetete DNA‐Menge können während der PCR im Tube gemessen werden
--> Amplifikation und Qantifizierung gleichzeitig

SYBR-Green-Markierung

Hybredisierung

Taq-Man Format

-SYBR-Green Substanz bindet an alle doppelsträngigen DNA
-durch die Bindung Fluoresziert die Substanz etwa 100x Stärker als ungebunden
-diese Fluereszenz kann gemessen werden

Nicht SPEZIFISCH

-zwei sonden binden während Annealing-Phase spezifisch an ziel-DNA
-eine sonde trägt einen Donor, der andere einen Akzeptor
-das angeregte Donor-Molekül überträgt seine Energie auf das sich in seiner Nähe befindende Akzeptor-Molekül
-Fluoresziert (Rot)
-Polymerase löst diese Sonden ab (Während DNA-Synthese)
-am Ende des Annealing wird die Fluoreszenz gemessen
= Die gemessene Fluoreszenz ist direkt proportional zur DNA-Konzentration


SPEZIFISCH

-Sonde mit zwei Molekülen : Reporter & Quencher
-Quencher unterdrückt die Fluoreszenz des Reporters
-Diese sonde bindet Spezifisch an DNA
-bei der DNA-Synthese baut die Polymerase diese sonde ab -> Fluoreszenz des Repoters nicht mehr unterdrückt = Fluoreszenz


SPEZIFISCH

Berechnung Tm-Wert :
Primer_forward: 14 x 2°C + 6 x 4°C = 52°C Primer_reverse: 16 x 2°C + 5 x 4°C = 52°C

Berechnung Ta-Wert :
Primer_forward: 52°C – 2°C = 50°C Primer_reverse: 52°C - 2°C = 50°C

MERKE:
Falls unterschiedliche Temp. muss es angepasst werden.

Mithilfe der DNA Sequenzierung kann die Basenabfolge eines DNA strangs ermittelt werden.

-dNTP's
-ddNTP's
-Polymerase
-Primer f oder R
-Puffer
-H2O

ddNTP's haben am 3' C-Atom nur ein H und nicht ein OH
-> kann keine darauffolgenden basen mehr binden.

https://www.youtube.com/watch?v=JcfnrJDTPG0

Kombi aus PCR, Gelelektrophorese und ddNTP's

-Polymersae fügt die Komplemeren Basen zu
-Bei einer modifizierten Base bricht sie ab (ddNTP)
-Durch diesen ''künstlichen'' Abbruch erhät man verschieden lange DNA-Stränge
-Diese verschieden Lange DNA-Stränge kann man mithilfe von einer Gelelektrophorese der grösse nach auftrennen

-> je kleiner umso früher

Proteinnachweis mithilfe Gelelektrophorese und AK

A
Proteine werden aufgetragen und nach Grösse aufgeteilt -> Gelelektrophorese

B
Mihilfe von Strom werden die Proteine auf eine Membran überführt -> Blotting

C
um die Proteine auf der Membran sichtbar zu machen, werden sehr Spezifische AK benutzt. Anschliessend wird ein Enzymmarkierter AK benützt, um die gebundenen Proteine sichtbar zu machen

D
Nun kann mithilfe der Grösse und der AK die Proteine nachgewiesen werden

eigenladung