11 MZB II - Lehner

Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können
-> unbegrenzte Vermehrung in Kultur (immortalisiert, transformiert) auf Grund von unbekannten oder bekannten genetischen Veränderungen (z.B. Reaktivierung von Telomerase, …)

in Suspension (im Kulturmedium schwimmend)
adhärent (auf dem Boden der Kulturschale ausgebreitet)

mesenchymal (z.B. Fibroblasten aus der Dermis)
epithelial (z.B. Keratinozyten aus der Epidermis)

Konfluenz: Zellen haben sich soweit vermehrt, dass die ganze Kulturschale von Zellen bedeckt wird.

Kontaktinhibition: Zellproliferationsstopp, der bei einigen Zelltypen in Folge von Konfluenz eintritt.

Passagieren: Die konfluenten Zellen werden von der Kulturschale abgelöst. Ein Teil davon wird in eine frische Kulturschale gegeben zur weiteren Vermehrung..

asynchrone Zellen:
Gemisch von G1-, S-, G2- und M-Phasen-Zellen.
(Falls der Zellzyklus = 24 h und G1 = 12 h, S = 6 h, G2 = 6 h, sowie M = 40min dauert, dann sind 50% der Zellen im Gemisch in G1, 25% in S, 25% in G2 und 2.8% in M.)

synchrone Zellen:
idealerweise 100% in entweder G1, S, G2 oder M

Induktionsmethoden: Synchronie wird erzwungen (induziert)

- durch Zugabe von Inhibitoren, die einen Zellzyklusarrest bewirken, z.B.:
  - Colchicin, Taxol (Mikrotubuli-Inhibitoren, Spindelgifte): -> Arrest in M
  - Aphidicolin (inhibiert DNA polymeraseα): -> Arrest zu Beginn der S-Phase

- durch Entzug von Serum/Wachstumsfaktoren/Mitogenen:
  -> Arrest in G1 (am sogenannten Restriktionspunkt, restriction point)

- durch Befruchtung gefolgt von synchronen Furchungsteilungen in bestimmten Invertebraten und Amphibien (Xenopus, Seeigel, Miesmuschel)

Selektion von Zellen in definierter Zellzyklusphase aus asynchroner Zellpopulation:

- durch Abschütteln (shake off) von abgerundeten mitotischen Zellen bei adhärent wachsenden Zelllinien

- mit „fluorescence-activated cell sorter (FACS)“: nach DNA-Färbung aussortieren von G1-, S-, oder G2/M-Zellen

FACS Fluorescence-activated cell sorting Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

Messung der Fluoreszenz-Signalintensität einzelner Zellen

Nach DNA-Färbung mit Fluoreszenzfarbstoff kann das Zellzyklusprofil (Histogramm) einer Zellpopulation bestimmt werden

Flächenintegration unter den Peaks: -> Bestimmung des Anteils von Zellen in der Population, die sich gerade in der G1-, S- bzw. G2/M-Phase befinden. Unter Annahme eines einheitlichen Zellverhaltens kann daraus die Länge der G1-, S- und G2/MPhase bestimmt werden, wenn vorher schon die Verdoppelungszeit bestimmt worden ist (durch Messung des zeitlichen Verlaufs der Zellzahl)

ausserdem ebenfalls informativ:
- sub-G1-Peak: apoptotische Zellen
- forward scatter (FSC): ein Mass für Zellgrösse

-Gene, Abk. für cell-division-cycle-Gene, Gene, die durch den mutationsbedingten Ausfall ihrer Genprodukte einen Stop im Zellzyklus bewirken und somit eine entscheidende Rolle beim Durchschreiten des Zellzyklus spielen. Am weitesten untersucht ist diese Klasse von Genen bisher bei Hefe.

Zur Identifikation von CDC-Genen wurden in Mutagenese-Experimenten HefeStämme mit Mutationen in CDC-Genen isoliert. Da die Progression durch den Zellzyklus jedoch nicht mehr möglich ist, wenn die Funktion von einem der gesuchten CDC-Gene durch eine gewöhnliche (nicht-konditionelle) Mutation zerstört wird, wurden konditionelle, temperatursensitive Mutationen isoliert und untersucht. D.h. es wurde nach temperatursensitiven Mutanten gesucht, die sich bei einer permissiven (niedrigen) Temperatur zwar noch vermehren können, aber nicht mehr bei restriktiven (hohen) Temperaturen. Von diesen temperatursensitiven Stämmen wurden diejenigen ausgewählt, die bei der restriktiven Temperatur noch bis zu einem bestimmten Punkt im Zellzyklus voranschreiten, dort dann aber arretieren und weiter anwachsen. Letzteres wird nicht erwartet im Falle von temperatursensitiven Mutationen in Haushaltsgenen (uninteressant für Zellzyklusregulation).

Die Zellmorphologie der Bäckerhefe verändert sich im Verlauf des Zellzyklus. Die Progression durch den Zellzyklus kann daher schon im Lichtmikroskop ohne besonderen methodischen Aufwand verfolgt werden (im Gegensatz zu tierischen Zellen, die sich während G1, S und G2 morphologisch nicht unterscheiden und sich höchstens allenfalls während der Mitose abrunden).

-> Es wurden ca. 60 CDC-Gene gefunden. Einige erwiesen sich als unabdingbar für die Progression durch die G1-Phase, andere für andere Zellzyklustransitionen.

Cyclin-abhängige Proteinkinasen (abgekürzt Cdk für Cyclin-dependent kinase) spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation der Progression durch den Zellzyklus.

Regulation durch Proteinkinasen und Phosphatasen

Cdks haben nur als Heterodimere mit Cyclinen Proteinkinaseaktivität. Cycline beeinflussen auch die intrazellulare Lokalisierung und die Substratsspezifität.

Cdks werden zudem durch Phosphorylierung an verschiedenen Positionen reguliert:
1. Phosphorylierung (von Threonin 160) durch CAK (Cdk-activating kinase) -> Aktivierung
2. Phosphorylierung (von Threonin 14 und Tyrosin 15) durch Wee1/Myt1- Kinasen -> Inhibition
Entfernung dieser inhibitorischen Phosphate durch Cdc25-Phosphatase

Cdks werden überdies durch inhibitorische Proteine (Cki: Cdk-Inhibitoren) gehemmt:
1. CIP/KIP-Inhibitoren (p21, p27) binden an Cyclin-Cdk-Komplexe und inhibieren diese.
2. INK-Inhibitoren (p14, …) binden an Cdk4/6 und inhibieren die Bindung des Cyclins.

Unterschiedliche Kontrollpunkte im Zellzyklus (Progression durch G1, G1/STransition, G2/M-Transition) werden durch verschiedene Cyclin-CdkKomplexe reguliert.

- G1-Cyclin-Cdk-Komplexe regulieren die Progression durch die G1 Phase.
- S-Cyclin-Cdk-Komplexe werden für den Beginn der DNA Replikation (S-Phase) benötigt.
- M-Cyclin-Cdk-Komplexe werden für die Mitose benötigt.

Eintritt in die Mitose als Folge der schalterartigen Aktivierung von Cdk1

Nach Akkumulation von M-Cyclin, M-Cyclin-Cdk1-Komplexbildung und aktivierender Phosphorylierung des Komplexes durch CAK erfolgt in der Interphase sofort auch die inhibitorische Phosphorylierung des Komplexes durch Wee1-Kinasen. Nur geringe Komplexmengen entgehen der inhibitorischen Phosphorylierung. In Folge weiterer M-Cyclin- und/oder Cdc25Phosphatasen-Akkumulation steigt die Menge an aktiven Komplexen an. Bei einer ausreichenden, kritischen Konzentration können diese aktiven Komplexe Cdc25 und Wee1 phosphorylieren. Dadurch wird die Cdc25-Phosphatasen-Aktivität erhöht und die Wee1-Kinase-Aktivität inhibiert. Die resultierende positive bzw. doppelt-negative Rückkoppelungsschlaufe führt zur explosionsartigen Aktivierung aller M-Cyclin-Cdk1-Komplexe. Durch Phosphorylierung vieler weiterer Substratproteine durch M-Cyclin-Cdk1-Komplexe wird die Mitose ausgelöst.

DNA damage checkpoint

Unvollständige DNA-Replikation und DNA-Schäden verhindern die Aktivierung von Cdk1. Die Progression durch den Zellzyklus wird daher in der G2-Phase arretiert, damit die Zelle mehr Zeit für DNA-Reparatur hat

M-Cyclin-Cdk1-Aktivität führt zu einer drastischen Reorganisation der Zelle
-> während Übergang (Pro- und Prometaphase): Chromosomen-Kondensation, Auflösung der Kernhülle, Spindelaufbau

Durch Abschalten der M-Cyclin-Cdk1-Aktivität in der Metaphase erfolgt die Reversion
->während Übergang (Telophase): Spindelabbau, Chromosomendekondensation, Aufbau der Kernhülle

durch ubiquitin-abhängige Degradation der M-Cycline

durch schnelle Aktivierung der Protease Separase, die die Cohesinringe zerschneidet, durch welche die Schwesterchromatiden zusammengehalten werden (Schwesterchromatiden-Kohäsion).

-> Cdk1 inaktiv

Cdk1 phosphoryliert neben vielen anderen Proteinen auch Untereinheiten des APC/C (Anaphase-promoting complex/Cyclosom). Nach APC/C-Phosphorylierung kann das Cdc20Protein an den APC/C binden. Der Cdc20-APC/C-Komplex erwirkt als Ubiquitinligase die Polyubiquitinierung von M-Cyclinen. Ubiquitin ist ein kleines Protein, dessen C-Terminus durch Isopeptidbindung mit -Aminogruppen von Lysinresten in anderen Proteinen verbunden werden kann. Polyubiquitinierte Proteine werden vom Proteasom abgebaut (in kurze Peptide zerstückelt). Ohne M-Cyclin kann Cdk1 keine Proteinkinase-Aktivität mehr entfalten, d.h. die zuvor von Cdk1 phosphorylierten Substratproteine werden sukzessive durch Phosphatasen wieder dephosphoryliert.

ein sorgfältig regulierter Prozess, an dem Enzyme vom E1-, E2- und E3-Typ beteiligt sind. Dank kombinatorischem Einsatz dieser Enzyme können unterschiedliche Proteine individuell gezielt beim Vorliegen von ganz bestimmten Bedingungen abgebaut werden.

Das Proteasom spaltet ubiquitinmarkierte Proteine

Endoprotease-Aktivität ist im Fass-förmigen Innern (central cylinder) des Proteasoms. Der Eingang ist mit einem Deckel verschlossen (unfoldase ring).
Polyubiquitin-Ketten wirken als Signal und erlauben Bindung an Proteine im Deckel sowie anschliessende Entfaltung der polyubiquitinierten Proteine und Einspeisung der Polypetidkette ins Fassinnere, wo der Abbau in kurze Peptide erfolgt

Viele Zellzyklusregulatoren (sowie andere Regulationsproteine) werden durch Polyubiquitinierung -> Degradation kontrolliert.
Der “rate-limiting step” ist die Erkennung und Polyubiquitinierung der Zielproteine durch Ubiquitin-Ligasen (E3-typ Enzyme)
-> CIP/KIP-Typ Cdk-Inhibitoren werden z. B. durch die Ubiquitin-Ligase SCF polyubiquitiniert, aber nur wenn die Cdk-Inhibitoren vorher phosphoryliert worden sind.

Cohesine sind Proteinkomplexe, die in der Zelle sowie bei der Mitose und der Meiose von entscheidender Bedeutung sind.

Cohesinmoleküle stabilisieren in der Zelle das Chromatingerüst und damit die dreidimensionale Struktur der Chromosomen.^[1] Während der Replikation der DNA in derS-Phase des Zellzyklus werden die beiden Schwesterchromatiden mit Hilfe der Cohesin-"Ringe" der gesamten Länge nach aneinandergebunden

Der Cdc20-APC/C polyubiquitiniert nicht nur M-Cycline sondern auch das Protein Securin

Securin bindet an Separase und inhibiert deren Proteaseaktivität. Nach Polyubiquitinierung-> Degradation von Securin: Separase wird aktiv. Sie erkennt eine Untereinheit des ringförmigen Cohesin-Komplexes und zerschneidet diese. Wegen der resultierenden Ringöffnung kann der Cohesin-Komplex die beiden identischen Schwesterchromatiden eines Chromosoms nicht mehr zusammenhalten. Die Schwesterchromatiden werden daher von der Spindel zu den entgegengesetzten Polen auseinandergezogen (Anaphase)

Der Spindelkontrollpunkt verhindert eine verfrühte Aktivierung von Cdc20-APC/C.
In der Centromerregion von Chromosomen bildet sich zu Beginn der M -Phase das Kinetochor aus. Dieser Proteinkomplex erlaubt das Anheften von Chromsomen an die Spindelfasern. Kinetochore, die noch nicht korrekt mit der Spindel verbunden sind aktivieren einen speziellen Signalweg, der als Spindelkontrollpunkt bezeichnet wird. Der aktivierte Signalweg führt zur Produktion von Inhibitoren (Mad2-BubR1-Bub3-Cdc20-Komplexe) die Cdc20-APC/C inhibieren. Die Zelle kann daher erst mit der Anaphase beginnen, nachdem alle Chromosomen richtig in der Spindel integriert worden sind.

lebende Zellen isolieren
->in Zellkultur vermehren
 ->Zellen in Mitose arretieren: Zugabe von Spindelgiften (z.B. Colchicin) zum Kulturmedium führt zur Aktivierung des Spindelkontrollpunktes und somit zu Zellzyklusarrest in der Mitose.
   ->mitotische Zellen auf Objektträger lysieren
    ->mikroskopische Charakterisierung der Chromosomen (nach Färbung oder FISH: Fluoreszenz in situ Hybridisierung) Kopienzahl von Autosomen und Geschlechtschromosomen, Chromosomenstruktur: Deletionen, Duplikationen, Translokationen

Nach der Mitose, in der G1 Phase kann die replikative Helikase (Mcm2-7) an die Replikationsursprünge rekrutiert werden (mit Hilfe von ORC, Cdc6 und Cdt1), weil in dieser Zellzyklusphase keine Cdk-Aktivität in der Zelle vorhanden ist.

Die Aktivierung der Helikase (und damit die Initiation der DNA-Replikation) erfolgt jedoch erst, nachdem in der Zelle S-Cyclin-Cdk-Aktivität (und die Aktivität einer weiteren Proteinkinase, DDK) exprimiert worden ist.

S-Cyclin-Cdk-Aktivität bewirkt nicht nur die Initiation der DNA-Replikation, sondern verhindert gleichzeitig auch, dass die Helikase noch einmal an bereits genutzte Replikationsursprünge rekrutiert werden kann. Reinitiation wird also verhindert (u.a. durch Phosphorylierung von Cdh1, was zur Inhibition des Cdh1-APC/C-Komplexes und damit zur Akkumulation des Cdt1-Inhibitors Geminin führt).

Erst nach der Mitose, kann in der nächsten G1Phase im folgenden Zellzyklus wieder Helikase an den Ursprung rekrutiert werden (nach mitotischer Degradation von Geminin nach Polyubiquitinierung durch Cdc20-APC/C)

DNA-Schäden verhindern in Säugerzellen auch den Eintritt in die S-Phase (nicht nur den Eintritt in die M-Phase)

in normalen Zellen ist p53 unstabil. Es wird durch die Ubiquitinligase Mdm2 erkannt, polyubiquitiniert und daher degradiert.
•DNA Schäden führen zur Aktivierung von Proteinkinasen (ATR, ATM, Chk1, Chk2) welche p53 und Mdm2 phosphorylieren. Dadurch wird die p53-Polyubiquitinierung verhindert. p53 akkumuliert, bildet Tetrameren und wandert in den Zellkern.
•Im Zellkern wirkt p53 als Transkriptionsfaktor und aktiviert die Expression von Zielgenen wie z.B. das Gen für den CIP-Typ Cdk-Inhibitor p21. p21 inhibiert G1-und S-Cyclin-CdkKomplexe und inhibiert somit den Eintritt in die S-Phase.
•Bei sehr starken DNA-Schäden und entsprechend starker p53-Aktivierung kann p53 ein Zell-Suizidprogramm (Apoptose) anschalten

• Bindung von Insulin oder IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) an den Insulin-Rezeptor (Inr) aktiviert den Signalweg.
•Eine Lipid-Kinase (PI3K) und die Proteinkinase (TOR: Target of Rapamycin) sind wichtige Elemente in diesem Signalweg.
•Die Lipid-Phosphatase PTEN ist der Gegenspieler von PI3K.

Die wichtigsten Tumorsuppressorgene sind p53, Rb und PTEN
-> p53, Rb und/oder PTENFunktion fehlt in den meisten Tumorzellen, weil sich in den entsprechenden Genen somatische Mutationen ergeben haben
  -> PTEN-Verlust beschleunigt das Zellwachstum
  -> Rb-Verlust beschleuigt die Zellzyklusprogression
  -> p53-Verlust führt zu einer erhöhten Mutationsrate (genetische Instabilität) und ausserdem können sich die geschädigten Zellen nicht mehr durch Apoptose entsorgen

-> Überlebensfähigkeit unabhängig von normalerweise erforderlichen extrazellulären Signalen (Überlebensfaktoren)
-> Zellwachstum und Zellvermehrung auch in Abwesenheit der normalerweise nötigen extrazellulären Signale (Wachstumsfaktoren, Mitogene), auch über die HayflickGrenze hinaus (keine replikative Seneszenz, Telomerase aktiv)
-> resistent gegen extrazelluläre Faktoren, die normalerweise Zellvermehrung hemmen und Differenzierung fördern
-> Organisation einer Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen (Angiogenese: Blutgefässbildung)
-> Umgehung von Immunabwehr -> Fähigkeit zum Auswandern und kolonisieren anderer Gewebe (Metastasierung)

=> Akkumulation all der erforderlichen Mutationen wird beschleunigt durch Mutationen, die bewirken, dass die Regulation der Progression durch den Zellzyklus nicht mehr korrekt funktioniert -> erhöhte genetische Instabilität