11 MZB I - Sartori

Das erste transkribierte Nukleotid: Position +1 (= Startstelle)
- Nukleotid 3’ (downstream, stromabwärts) der Startstelle: Position +2, etc.
- Nukleotid 5’ (upstream, stromaufwärts) der Startstelle: Position -1, etc.

Als Matrizenstrang bezeichnet man den Strang der DNA-Doppelhelix, welcher während derTranskription von der RNA-Polymerase II abgelesen und in mRNA umgeschrieben wird. Auch bei derDNA-Replikation dient der Matrizenstrang als Vorlage.

Als Promotor, wird in der Genetik eine Nukleotid-Sequenz auf der DNA bezeichnet, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht. Der Promotor ist ein essenzieller Bestandteil eines Gens. Er liegt am 5'-Ende des kodierenden Stranges des Gens und somit in Syntheserichtung vor dem RNA-codierenden Bereich.

-> teilt der RNA-Polymerase mit wo sich die Startstelle befindet

Initiation, Elongation und Termination

s.B.

s.B.

s.B.

Bakterien besitzen eine einzige RNA-Polymerase, die aus mehreren Untereinheiten besteht:

Untereiheit: ¦Anzahl: ¦ Funktion
α                  2            Bindet regulatorische Sequenzen
β                  1            Bildet Phosphodiesterbindungen - Polymerase Aktivität
β”                 1            Bindet die DNA-Matrize
σ⁷⁰              1            Erkennt den Promotor und initiiert die Synthese
ω                 1            nicht-essentielle Untereinheit, Stabilisiert den Komplex

Core-Enzym (ohne σ):                          α2ββ'ω   (ca. 400 kDa), aktiv, aber unspezifisch
Holoenzym mit 6 Untereinheiten:         α2ββ'σω (ca. 480 kDa)

(-> Zur Elongation löst sich die σ-Untereinheit ab und das Core-Enzym allein übernimmt die Transkriptionstätigkeit)

RNA-Polymerasen in Eukaryoten:
• Pol-I: Synthese der ribosomalen RNA (rRNA)
• Pol-II: Synthese der messenger RNA (mRNA)
• Pol-III: Synthese der transfer RNA (tRNA)

Die Zusammensetzung der Untereinheiten ist bei allen RNA-Polymerasen ähnlich

-> Nur die eukaryotische RNA-Pol II (RPB1 Untereinheit) hat eine C-terminale Domäne (CTD) die während aktiver Transkription phosphoryliert wird

Ein Operon ist eine Funktionseinheit der DNA von Prokaryoten (und manchen Eukaryoten), bestehend aus Promotor,Operator(en) und mehreren (Struktur-)Genen, die für Proteine mit typischerweise verwandten Funktionen codieren.

an operon is a functioning unit of genomic DNA containing a cluster of genes under the control of a single promoter

Als Polycistronisch wird in der Genetik eine mRNA bezeichnet, die von mehreren, hintereinanderliegenden Cistrons (Gene) auf der DNA codiert wird. (Diese mRNAs enthalten also mehrere offene Leserahmen (ORFs)). Im Gegensatz zu den monocistronischen eukaryotischen mRNAs codieren die vorwiegend polycistronischen mRNAs der Prokaryoten mehrere Gene

Als Monocistronisch wird in der Genetik eine mRNA bezeichnet, die ein einzelnes Cistron codiert, das einem Gen entspricht. (Diese mRNAs enthalten also nur einen offenen Leserahmen).

Prokaryoten:
Transkription und Translation geschehen gleichzeitig, am selben "Ort" (Cytoplasma)

Eukaryoten:
RNA-Synthese (Transkription) und RNA-Prozessierung im Zellkern; Translation im Cytosol
-> Transkription und Translation sind in Eukaryoten zeitlich und räumlich getrennt

Die σ-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase erkennt zwei Konsensus DNA-Sequenzen
innerhalb des Promotors, der sich upstream (‘stromaufwärts’) des Transkriptionsstarts befindet

Sigma-Faktoren weisen eine hohe Affinität zur Pribnow-Box und der -35-Sequenz des Promotors auf. Damit erhöht sie die Bindewahrscheinlichkeit des Polymerase-Holoenzyms an die Startstelle des offenen Leserahmens der DNA.

RNA-Pol assoziert mit verschiedenen Sigma-Transkriptionsfaktoren (je nach Umweltbedingung):
- σ70 (rpoD) bindet an Standard-Promotoren (bei normalen Wachstumsbedingungen)
- σ54 (rpoN) erkennt und bindet bei -35 und bei -10 andere Konsensussequenzen (bei Stickstoffmangel)
- σ32 (rpoH) erkennt und bindet bei -35 und bei -10 andere Konsensussequenzen (bei Hitzestress)

E. coli kontrolliert die Expression der Gene des Laktose-Metabolismus in Abhängigkeit von Substratverfügbarkeit (Laktose/Glukose)

Die bervorzugte Energiequelle für Bakterien ist Glukose.
Das lacZ-Gen codiert für das Enzym β-Galactosidase: spaltet Laktose in Galaktose und Glukose.

• sind (wie Promotoren) kurze, regulatorische Abschnitte in der DNA mit charakterischer Sequenz, die von Transkriptionsfaktoren (TFs) gebunden werden.
• können sehr weit vom Promoter entfernt liegen (bis zu 1 kb upstream oder downstream von der Transkriptions-Startstelle, bei Eukaryoten bis zu 100 kb!)
• beeinflussen (positiv) die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promotor
• verstärken die Transkription eines Gens (es gibt auch ‘Silencer’)
• kommen universell vor (ausgeprägter in Eukaryoten)

1. RNA pol core enzymes associates with a σ factor (a).
2. The holoenzyme binds to a promoter, creating a “closed complex” (b).
3. Sigma factor promotes initial melting of DNA, generating an “open complex” (c).
4. The first nucleotide binds to the position +1 (Startstelle) (c).
5. The second nucleotide (position +2) binds; RNA pol catalyzes the first phosphodiester bond (d).
6. The core polymerase escapes from the promoter, leaving the sigma factor behind (d, e)

Eukaryotische RNA-Polymerasen erkennen Promotorsequenzen upstream des Transkriptionsstarts

Für die Initiation werden (wie in Bakterien) besondere Erkennungssequenzen im Promoter gebraucht, die von TFs gebunden werden um die Transkription zu aktivieren:
- TATA-Box (-25 bis -30 bp)
- ‘Promoter-proximal elements’ die 50-150 bp weiter stromaufwärts der TATA-Box liegen:
  - GC-Box (GC-reich)
  - CAAT-Box

Als Konsensussequenz wird diejenige Sequenz (von Nukleotiden oder Aminosäuren) bezeichnet, welche in der Summe am wenigsten von einer gegebenen Menge von entsprechenden Mustersequenzen abweicht.

Allgemeine TF ermöglichen der RNA-Pol II die Initiation der Transkription

1. TBP (TATA-Box Binding Protein, Untereinheit von TFIID) bindet and die TATA-Box im eukaryotischen Promotor.
2. Dies führt zur sukzessiven Bindung von anderen TF (u.a. TFIIA und TFIIB)...
3. ...und schlussendlich zur Rekrutierung der RNA-Polymerase II. Ausbildung des Prä-Initiationskomplex (PIC) am Promotor.
4. Durch Schleifenbildung können, an weit entfernte Enhancergebundene, Aktivatorprotein (Act) mit dem Promotorgebundenen PIC interagieren.

Spezifische Transkriptionsfaktoren vermitteln der Polymerase, welches Gen zu welcher Zeit aktiviert werden soll. Sie sind daher nur in den Zellen vorhanden, in denen das Gen, welches sie regulieren, aktiviert (oder je nach dem auch reprimiert) werden soll.

Beispiele für gen-spezifische TF: p53, NF-κB, Glucocorticoid-Rezeptor (GR)
p53: -> Tumor supressor gen ("verhindert Krebs")("Guardian of the Genome")(53 kDa)

Als Enhancer bezeichnet man nicht transkribierte Gensequenzen - meist im 5'-Bereich vor einem Gengelegen, die nach der Bindung der Transkriptionsfaktoren an den Promotor eines Gens dessen mRNA-Produktion verstärken können. Somit steigern Enhancer die Transkription spezifischer Gene.

Kernrezeptoren (auch: nukleäre Rezeptoren (NR) oder ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren) sind spezielle Proteine, die im Zellkern von mehrzelligen Tierenvorkommen. Es handelt sich um Transkriptionsfaktoren, die erst durch die Bindung einesLiganden (meist Hormone) in der Lage sind, an DNA zu binden und die Transkription eines oder mehrerer Gene zu unterdrücken oder in Gang zu bringen.

BSP: Glucocorticoid-Rezeptor (GR) gehört zur TF-Familie der "nuclear receptors"

‘Nuclear Receptor’-TF binden DNA mittels "Zink-Finger"-Domänen

- Entwicklungs-spezifische Regulation
- Zelltyp-/Gewebe-/Organ-spezifische Regulation

- Regulation durch Signale von aussen:
  a. Protein-Signale
     - dringen nicht in Zelle ein
     - binden deshalb an Membran-Rezeptoren (Signaltransduktion)
  b. Steroidhormone
     - fettlöslich, passieren die Lipidmembran und dringen direkt in Zelle ein
     - und binden Steroid-Rezeptoren (nuclear receptors) im Zytoplasma

Der Glucocorticoid- und der Estrogenrezeptor binden als Homodimere an 'inverted repeats'.
-> ‘gegenläufige Wiederholungseinheiten’ Palindrome: gleiche Sequenz auf dem komplemenären Strand

Die Vitamin D3-, Thyroxin- und Retinolsäurerezeptoren bilden
Heterodimere mit RXR, und binden an 'direct repeats', die sich nur in der Anzahl dazwischengeschalteter Nukleotide unterscheiden (N)3,4,5.

Der Glukokortikoid-Rezeptor ist ein intrazellulärer Hormonrezeptor, der Glukokortikoide bindet. Er gehört zur Klasse der Liganden-aktivierten Transkriptionsfaktoren.

Glucocorticoid-Rezeptor (GR) gehört zur TF-Familie der "nuclear receptors"

Der Glucocorticoidrezeptor bindet als Homodimer an 'inverted repeats‘ im GR Enhancer.

Glucocorticoid-Rezeptor (GR) besteht aus zwei identischen Untereinheiten
(=Homodimer), die je zwei Zink-Ionen komplexieren (Cys4-Typ).

Hormonbindung 'aktiviert' die nuclear receptors, indem sie ihre Translokation vom Cytosol in den Zellkern induziert

BSP: Hormon-induzierte Translokation des Glucocorticoid-Rezeptors (GR) vom Cytosol in den Zellkern führt zur Bindung des GR an spezifische Promotor-Elemente und somit zur Transkriptions-Initiation. Transaktivierungsdomäne (AD) des GR interagiert nach sequenzspezifischer DNA bdg (inverted repeat) mit TBP (Tata-Binding Protein) und HistonAcetyltransferase (HAT)

1. regulieren die Initiation der Transkription, indem sie die Zusammenlagerung des “Prä-Initiationskomplexes” bewirken (z.B allgemeine TF)
2. beeinflussen lokal die Kompaktheit des Chromatins und damit die Zugänglichkeit der DNA für Proteine wie die RNA Polymerase (z.B nuclear receptors)

Die Kondensation/Packung des Chromatins wird durch Acetylierung von Histonen beeinflusst

Reprimierende bzw. aktivierende TF beeinflussen den Acetylierungsstatus benachbarter Nukleosomen und damit die Zugänglichkeit der in ihnen verpackten Promotorsequenzen

Histon-Deacetylase (Lys+) EFFEKT: Transkription OFF
Histon-Acetyltransferase (Lys-Ac) EFFEKT: Transkription ON

(TF steht fürTranskriptionsfaktor, II für Polymerase II,  X benennt den Faktor selbst)

1.  TATA-box binding protein (TBP) bindet an TATA-Box
2. Es assoziiert nun der TFIIB, welcher dafür sorgt, dass die Polymerase II gebunden werden kann
3. Der TFIIF führt nun die Polymerase II zum Promotor
4. der TFIIE, der das Andocken desTFIIH ermöglicht
5. (Der TFIIH besitztHelikase- sowie Protein-Kinase-Aktivität)
6. Elaongation: Ausser TBP dissozieren alle allg. TF

In Prokaryoten löst sich die Polymerase vom σ-Faktor ab, welcher am Promotor gebunden bleibt um die “nächste” RNA-pol zu rekrutieren
->Dieser Zyklus gschieht solange, bis genügend mRNA Moleküle eines Gens synthetisert sind.

Dasselbe gilt für TBP in Eukaryoten. Damit sich die RNA pol II vom Promoter absetzen kann, ist bei Eukaryoten zusätzlich die Phosphorylierung der C-terminale Domäne (CTD) der RNA pol II notwending

Transkriptionsblase (vorübergehende Oeffnung von ca. 18 nt) bewegt sich mit der RNA pol

RNA polymerasen sind viel “langsamer” als DNA polymerasen! Beispiel: E. coli RNA pol synthetisiert ~ 50 Nukleotide/Sekunde (DNA pol: 500-1000 nt/s)

Halilkase:
Eukaryoten: Die Entwindung der DNA in der Transkriptionsblase wird von TFIIH vorangetrieben. TFIIH besteht
u.a. aus XPB und XPD, zwei Untereinheiten mit DNA Helikase Aktivität (die auch in der Nukleotid Excisions-Reparatur beteiligt sind)
Prokaryoten: σ-Faktor enthält Helikase-Aktivität

Prozess benötigt Mg2+ ionen

- Spezifische DNA Sequenzen (sog. Terminators) bestimmen das Ende der Transkription
- Bakterielle RNA polymerasen stoppen nachdem sie die Terminatorsequenz transkribiert haben
- Es gibt zwei grundsätzliche Formen der Termination:
   – Rho-unabhängig: 50% (intrinsisch, ohne zusätzliche Faktoren)
   – Rho-abhängig: 50%. Das ρ-Protein ist eine ATP-abhängige Helikase, die RNA-DNA hybride in der Transkriptionsblase entwinden kann

(Die Stoppsignale in Eukaryoten sind noch nicht vollständig aufgeklärt)

Rho-unabhängige Terminatoren haben zwei Eigenschaften:
– Inverted repeats, welche zur Ausbildung einer Haarnadelschleife führen sobald sie in RNA umgeschrieben sind
  -> RNA polymerase wird durch die Haarnadelstruktur gebremst oder sogar angehalten
– poly-A Sequenz auf dem DNAMatrizenstrang (resultiert in einer poly-U Sequenz in der RNA)
  -> A/U DNA/RNA Hybrid (stark geschwächten Paarung der RNA mit DNA in der Transkriptionsblase) führt zum Ablösen der RNA vom Matrizenstrang

Nachdem die RNA dissoziert ist, fällt auch die RNA polymerase ab