VMTA Immunhystologie
Antikörper, Darstellung von Antigenen
Antikörper, Darstellung von Antigenen
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Cartes-fiches
Beschreiben Sie den routinemäßigen Ablauf einer Einbettung in der Histologie und Immunhistologie. In welchen Schritten Stimmen sie überein, wo unterscheiden sie sich?
Histologie (Paraffineindeckung):
- Probenentnahme
- Fixation mit 10% Formalin
- Spülung mit fließendem Wasser
Einbetten
- Dehydratation
- Intermedium ( Löslich in Entwässerungs und Einbettmittel)
- Einbettmittle
- Ausguss und erstarren
5. Schneiden
6. Färben
7. Eindecken
Immunhisto: Bis zu Punkt 5 identisch. Fixation mit 4% Formalin. Darstellng von Antigen/ Immunreaktionen
Was bedeutet T und B Lymphozyt?
T- Lymphos: Kommen unreif aus dem Knochenmark und reifen im Thymus
Zellvermittelte oder zelluläre Immunität über zellständige Rezeptoren
B- Lymphos: Bone MarrowHumorale Abwehr über in Plasmazellen gebildete Antikörper, als als Immungloboline abgegeben werden
Welche Zellen produzieren Immungloboline? Wie heißen die Vorläuferzellen?
Plasmazellen
Vorläufer: B- Lymphozyt
Nennen Sie 5 Immunglobolintypen
IgG, IgA, IgM, IgE, IgD
Nennen den strukturellen Unterschied von IgA und IgG
IgA: Dimer IgG: Monomer
Wofür steht FC?
Fragment crystalized
Unterer Abschnitt des Antikörpers
Wofür steht FAB?
Antigen- Binding- Fragment (Antigenbindendes Fragment)
Oberer Teil des Antikörpers
Was ist der Unterschied zwischen polygonalen und monoklonalen Antikörpern?
Monoklonal: Werden nur von Klonen einer einzelnen B-Zelle hergestellt, gegen ein Epitop eines Antigens gerichtet
Polyklonal: Nachkommen vieler verschiedener B- Zellen. Gegen mehrere, verschiedene Epitope von Angtigenen gerichtet
herstellung monoklonaler Antikörper
- Maus wird mit Antigenen infiziert
- Aufgrund der Immunantwort werden B-Lymphozyten gebildet. Diese wiederum bilden Antikörper, die sich in der Milz anreichen
- isolierung der B-lymphozyten und Zusammenführung mit einer, aus einem Myelom (Plasmozytom), gewonnen Zelllinie
- Fusion der beiden Zelltypen
- Entstehung von Hypridomzelllinien
- Hybridomzellen behalten die Fähigkiet zur ANtikörperproduktion und vermehren sich unbegrenzt
- Produktion der Antikörper kann in vitro und in vivo erfolgen
- Die Antikörper sind monoklonal, da sie aus einer einzigen Urpsungs- B Zelle stammen
Herstellung polyklonaler Antikörper
- Infizierung eines Tieres mit Antigenen, bsow viralen Proteinen.
- Immunreaktion erfolgt, Tier bildet spezifische Antikörper gegen das Protein
- Entstehung eines natürlichen gemisches, mehrerer verschiedener ANtikörper, die mit unterschiedlicher Affinität an eines der verschiedenen Epitope des Antigens binden.
Kreuzreaktion?
Antikörper gegen Erreger A, kann sich auch an Erreger B binden, da beide die gleichen oder sehr ähnliche Epitope besitzen
Wi erkennt der körper Antigene?
Durch das körperfremde Eiweiß von bakterien und Viren
Antikörper können nur Eiweiße angreifen
Über welche mikroskopische Technik wird FITC visualisiert?
Fluoreszenzmikroskop
Was ist ein Konjugat?
Antikörper mit Detektionssystem
Nennen sie drei Fluororchrome und ihre Farbsprektrum.
Bei welcher Wellenlänge wird FITC visualisiert?
FITC: Fluorescein- Isotihocyanat
Anregungsspektrum: 490nm Farbe: Grün (517nm)
TRITC Tetramethylrhodamin-Isotihocyanat
Anregungssektrum: 510/545 nm Farbe: orangerot (540nm)
RB200SC: Lissamin- Rhodamin- B200- Sufonylchlorid
Anregungssprektrum: 560nm Farbe: Rotorange: 590nm
DANS: Diaminouaphtylsufonsäure
Farbe: Gelb (340nm)
Nenne zwei gängige Enzyme der Immunhistochemie
Peroxidase, Alkalische Phosphatase
Worin besteht der wesentliche Unterschied zwischen direkter und indirekter Methode in der Histochemie?
Direkte Methode: Spezifischer ANtikörper wird dirket mit Detektionssystem gekoppelt
Indirekte Methode: Detektionssystem wird an Sekundärantikörper gekoppelt.
Nennen Sie den wesentlichen Vorteil der indirekten technik bei der Immunhistologie.
- Herstellung von Antikörpern, die gegen verschiedene Antigen gerichtet sund (mit einem einzigen Konjugat kann man verschiedene Primärantikörper nachweisen)
- Mehr Markierungen
Wie kann die endogene Peroxidase nachgewiesen werden? Wie lässt sich die endogene peroxidase hemmen?
Nachweiß im Schnitt: H2O2+ DAB = braunfärbung (Phenacin)
Hemmung: H2O2 Überschuss
Welche Funktion hat das Diaminobenzidin beim peroxidasenachweis über H2O2?
Elektronendonator
AEC, DAB: Farbprodukt?
Was verbirgt sich hinter dem Kürzel DAB und AEC
AEC: 3-Amino-9-Ethyl-Carbazol -> Rote Farbe
DAB= Diaminobenzidin -> Braune Farbe
Nachweise der alkalischen Phosphatase
Primärrekation:
Substrat alkalische Phosphatase (Aromatischer Ring) + PO4+H2O
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Sekundärrektaion:
Simultane Azokupllung
(Aromatischer Ring) Diazonion Salz Azufarbstoff
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Farbe des Salzes bestimmt die Azofarbe. Beides läuft gleichzeitig ab
Nennen Sie die Unterschiede zwischen alkalischer Phosphatase und Peroxidase?
Alkalische Phosphatase:
- Exogen: Kälberdarm
- Endogen Mikrovillisaum der Enterozyten
- Hemmung durch levamisolen
- Nachweis Simulatane Azokupplung
Peroxidase:
- Exogen meerrettichwurzel
- Endogen Erythrozyten
- Hemmung durch H2O2 Überschuss
- Nachweis durch H2O2+DAB
Direkte Methode
- Der spezifische Antikörper (monoklonal) ist direkt mit dem Detektionssystem gekoppelt
- Detektionssystem ist chemisch am Antikörper gebunden
- Dadurch kann sich bei Zugabe des Detektionssystems der Antikörper verändern, bzw dessen FAB Abschnitt, sodass dieser nicht mehr bindet
- Vorteil: Einfache Technik
Nachteil: Für jedes Antigen, das nachgewiesern werden soll, muss ein konjugierter Antikörper vorhanden sein
Indirekte Methode
- Es werden zwei verschieden Antikörper benutzt
- Primärer Antikörper (bspw von der Maus) bindet sich an das Antigen
- man gibt sekundären Antikörper dazu, der nsich an den primären Antikörper bindet, da er gegen Mäuse Antikörper gerichtet ist
- Am sekundären Antikörper befindet sich Detektionssystem
- Vorteil: Man braucht nur eine Sorte von konjugierten Antikörpern, um Antigene nachzu weisen.
- Nachteil: Längere Zeit, Höher unspezifische Bindung
Doppelt indirekte Methode
- Primärer Antikörper aus Spezies A bindet sich an ANtigen
- Sekundärer Antikörper aus Spezies B besitzt Konjugat und bindet sich an ANtikörper A
- Tertiärer Antikörper aus Spezies C ist ebenfall konjugiert und bindet sich an Antikörper B
- Vorteil: Signalvertsärkung
- Nateil: Sterische Behinderung
Nennen Sie den wesentlichen Vorteil der indirekten Technik bei der Immunfluoreszenz
man verwendet für die aus Tierspzies A hergestellten Primärantikörpern den gleichen, konjugierten Sekundärantikörper. So kann man mit einem einzigen Sekundärantikörper verschiedene Antigene anchweisen
Wie mussder Brückenantikörper bei der PAP- Methode im Vergleich zum Primärantikörper eingesetzt werden?
Im Überschuss und unkonjugiert
Wie ist ein PAP Komplex aufgebaut?
Zwei Antikörper mit drei Molekülen Peroxidase in der Mitte
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Was verbirgt sich hinter dem Kürzel APAAAP?
Alkalische Phosphatase Anti Alkalische Phosphatase
