Gentransfer

Übertragung von DNA von Bakteriophagen oder Viren in ein Bakterium

über Zelleigenen Replikationmaschinerei vermehrt --> Virus Partikel hergestellt und mittels Zelllyse freigesetzt

Aufnahme von DNA in Säugertierzellen

transient

• nicht in Wirts-DNA eingebaut
• Expression nur kurzzeitig
• wird bei Zellteilungen ausgewaschen
• große Anzahl an Proben in kurzer Zeit

stabil

• ins Genom eingebaut
• stabil, aber geringere Effizienz

Die Fähigkeit einer Zelle DNA aus der Umgebung aufzunehmen.

Kann natürlich sein, muss aber meist im Labor durch physikalische oder chemische Methoden induziert werden (auch E.coli)

Ist ein Maß für die Kompetenz der Zellen. = die Anzahl der Kolonien pro 1μg eingesetzte DNA.

Unter optimalen Bedingungen: 106-107 Kolonien pro 1μg eingesetzter Plasmid-DNA

• chemische Transfomation (durch CaCl2)
• Elektroporation

genauer Mechanismus noch nicht geklärt

• Durch Zugabe von CaCl2 kompetent gemacht (Ca2+ Ionen schwächen negative Ladungen der DNA ab --> Annäherung an ebenfalls negativ geladene Zellmembran)
• DNA hinzugegeben
• ~30min auf Eis inkubiert
  reduziert thermische Bewegeung --> DNA kann leichter ansetzen
• 2 minütiger Hitzeschock bei 42°
  plötzliche Änderung der Fluidität der Membran (leichter durchlössig) + Sogwirkung durch Temperatur-Unterschied innen und außen

Effektivste Methode (107 – 1010 Kolonien pro 1μg eingesetzter Plasmid-DNA) --> Herstellung von Genbanken

Elektrischer Impuls macht die Zellmembran kurzzeitig durchlässig für DNA in dem es durch eine Konformationsänderung Poren in der Membran öffnet

• Kolonien wachsen lassen
• Abkühlen
• Zentrifugieren
• Mit eiskaltem Puffer oder Wasser waschen (mindert die Ionenstärke, verhindert später elektrischen Durchschlag)

Muss für jeden Zelltyp neu optimiert werden.

Problem: Salzkonzentrationen der Vektorpräparation kann Elektroporation stören. Reinigung durch Chlor/Phenol-
Extraktion oder Alkoholfällung (aber DNA Verlust)

Durch Mikroinjektion

Mit feiner Glaskapillare wird DNA in Zelle (z.B. Eizelle) oder direkt in den Zellkern eingeschleust

Zur Herstellung transgener Tiere

SELEKTION
Ob Plasmid-DNA auch wirklich aufgenommen wurde. = Effektivität der Transformation. Mit Hilfe von Antibiotika-Resistenzen

SCREENING
Welche der Zellen hat ein Plasmid mit Insert aufgenommen = Effektivität der Klonierung.
Insertion des Target Gens unterbricht ein Reporter-Gen --> kein vollständiges Protein mehr erzeugt --> kann nachgewiesen werden
z.B. Blau-Weiß-Selektion
Plasmid enthält Gen für β-Galactosidase, die normalerweise XGal unter Produktion eines blauen Farbstoffs abbauen würde --> Gen unterbrochen --> kein Enzym --> keine blaue Farbe

• Zellen mit dem ungeschnittenen Vektor tranformiert
• Zählen der Kolonien
• Transformationseffizienz ermittelt

Bei eigentlichem Versuch kann dann beobachtet werden, ob das Insert die TE beeinflusst

Auftragen von Zellen auf das Medium ohne Fremd-DNA (nicht transformiert)

--> Es sollten keine Kolonien wachsen, da keine Resistenzen vorhanden sind (wären auf dem Plasmid)

Ursachen wenn trotzdem etwas wächst:

• Bakterienzellen oder Reagenzien könnten mit resistentem Stamm kontaminiert sein
• Selektionsplatte könnte Störung haben: Antibiotikum vergessen oder in zu heißes Agar gegeben
• Selektionsplatte mit resistentem Stamm kontaminiert

• Klonierung und Vervielfältigung von Plasmiden bzw. DNA Fragmenten
• Produktion von Proteinen