Einführung in die analytische Chemie: Chromatographie

• Messgrösse
  • Detektorsignal als Funktion der Bruttoretentionszeit
• Totzeit
  • Kleinste mögliche Retentionszeit für Substanzen, die keine Wechselwirkung mit der stationäre Phase eingehen (= Zeir der Lösungsmittelfront)

• Bruttoretentionszeit
  • Zeit zwischen Aufbringen der Komponenten auf die Säule (injektion) und der Detektion (Peakmaximum)
• Nettoretentionszeit
  • Differenz aus Bruttoretentionszeit und Totzeit
• Trennfaktor α (Selektivität)
  • Relative Retention zweier Substanzen
  • Definitionsgemäss α > 1; α = 1 bedeudet beide Substanzen eluieren gleichzeitig (-> keine Trennung).
  •   \(α = {t'_R(C) \over t'_R(B)}\)

Bezieht die Signalformen zur Beschreibung der Trennung mit ein 

• Messgrösse
  • Detektorsignal (quantitative Information = Fläche unter dem Peak) als Funktion der Bruttoretentionszeit (qualitative Information)
• Eluation
  • Transport eines Moleküls durch die Säule aufgrund kontinuierlicher Zugabe von mobiler Phase

• Eluent
  • mobile Phase
• Chromatogramm
  • Signal-Verlauf eines Detektors in Abhängigkeit von der Zeit 
• Peak
  • Anzeige, wenn der Analyt detektiert wird

Vergl Tabelle

• Streudiffusion/Wirbeldiffusion/Eddy-Diffusion (A-Term)
  • Diffusion durch Verwirbelung in gepackten Säulen durch unterschiedliche Flusswege
  • unabhängig von Strömungsgeschwindigkeit
• Longitudinaldiffusion (B-Term)
  • Diffusion in Längsrichtung; abhängig von Viskosität und Temperatur
  • abhängig vom Kehrwert der Strömungsgeschwindigkeit
• Massentransfer (C-Term)
  • Massenübergang zw. stationärer und mobiler Phase
  • direkt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit

• Minimum der Funktion der van-Deemter-Gleichung
  • HETP (high equivalent to a theoretical plate / theoretische BodenhöheI minimal
  • Effizienz der Trennung erreicht maximalen Wert
  • Für Trennung optimale mittlere Geschwindigkeit der mobilen Phase

• Die am weitesten verbreitete analytische Technik
• Methode der Wahl für die Trennung flüchtiger Verbindungen (org. und anorg.)
  • Molekulargewichtsbereich von 2 bis > 1000
• Mobile Phase: Wasserstoff oder Helium
• Säulen:
  • gepackt (selten)
  • Dünnschichtsäulen (5-50ym)
  • Dünnfilmsäulen (0.1-8ym)

• GC-Trennungen oft weniger Komplex als HPLC-Trennungen
• Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer (kleinere Diffusionskoeffizienten)
• Selektivität hängt nicht nur von der stationären Phase ab, sondern auch von der mobilen Phase (laufmittel
• Bei der GC nur Trennung von Substanzen, sie sich bis ca. 400°C unzersetzt verdampfen lassen

• Säulendurchmesser: 1-4mm
• Säulenlänge 100-250mm
• Betriebsdruck: 50-350 bar (UHPLC bis 1'000)
• Geschwindigkeit der mobilen Phase: ca 1mm/S (ml/min)

• AS, Proteinen, Nukleinsäuren
• Kohlenwasserstoffen, Kohlenhydraten
• Arzneimitteln, Antibiotika, Steroiden
• Terpenen, Pestiziden
• Metallorganischen Verbindungen
• Ionische Verbindungen

• Pumpsystem
• Injektor
• Trennsäule
• Detektor

• Isokratisch
  • Ein ELuent mit konstanter Zusammensetzung
• Gradientenelution
  • Zwei oder mehr Eluenten mit unterschiedlicher Zusammensetzung, deren Mischungsverhältnis im Laufe des Chromatogramms geändert wird
  • Elutionskraft der mobilen Phase nimmt im Laufe des Chromatogramms zu
  • Beschleunigung von Peaks, die sonst spät oder überhauptnicht eluiert würden
  • Einsatz bei komplexer Trennproblemen

1-500yl

• Streuung
  • Brechungsindex (RI) Detektor (Gradientenelution nicht möglich)
  • Lichtstreuung nach Vernebelung 
• Optische Aktivität
  • UV/VIS und DAF (Diodenarray) Detektor
  • Fluorszenzdetektor (Analyten fluoreszieren oder können derivatisiert werden)
• Elektrochemisch
  • Elektrochemischer Detektor (elektroaktive Substanzen, die sich oxidieren oder reduzieren lassen)
  • Leitfähigkeitsdetektor (ionenchromatographie)
• Instrmentelle Analytik
  • MS (org. Analytik)
  • ICP-OES/ICP-MS (Elementanalytik)
  • NMR (Strukturaufklärung) 

• Normalphasenchromatographie
  • Stationäre Phase: polar
  • Mobile Phase: unpolar 
  • Heutzutage weniger angewante Methode, kommt aber in der pharmazeutischen Analytik noch zum Einsatz
• Umkehrphasenchromatographie (Reversed-Phase, RP)
  • Stationäre Phase: unpolar
  • Mobile Phase: polar 
  • Heute überwigende HPLC-Anwendung

• Poröse, sphärische Mikropartikel aus Silicagel (Kieselgel)
• Polare/unpolare Funktion durch chemisch gebundene Phase

• Auswahlparameter
  • Balance der intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Analyt und den beiden Trennphasen
  • Polarität der mobilen Phase anhand der elutrope Reihe der Lösungsmittel
• Prinzip
  • Polaritätsindex P --> numerisches Mass der relativen  Polarität von Lösungsmitteln
• Polaritätsindex P
  • durch Mischen von geeigneten Lösungsmitteln --> Einstellung beliebiger P

• Anwendung:
  • Trennung von Ionen an Ionenaustauscherharzen
  • Detektion: Leitfähigkeitsmessung nach Supression (Unterdrückung) der Grundleitfähigkeit des Eluenten
• Austauschreaktion:
  • Anionen (quartäre Ammoniumgruppen): Harz-N⁺R3OH^- + Anion^- → Harz-N⁺R3 Anion^- + OH^-
  • Kationen (Sulfonat-Gruppen): Harz-SO₃^-H⁺ + Kation⁺ → Harz-SO₃^- Kation⁺ + H⁺
• Elutionsreihenfolge:
  • Generell:
    • polyvalente Ionen werden stärker zurückgehalten
    • „weiche“ Ionen mit grosser Elektronenhülle werden stärker zurückgehalten
  • Kationen: Li⁺ <H⁺ <Na⁺ <NH₄+ <K⁺ <Mg²⁺ <Ca²⁺
  • Anionen:  F^- < OH^- < H3CCOO^- < HCOO^- < Cl^- < Br^- < NO^2- < NO^3- < I^- < SO₄^2- < C₂O₄^2-

28 

Bild

• Verteilung nach der Molekülgrösse aufgrund eines Siebeffekts
  • Kleine Moleküle dringen in alle Poren ein, ihnen steht das gesamte Volumen der stationären Phase zur Verfügung
  • kleine Moleküle werden daher zuletzt eluiert

• Trennung aufgrund von selektiven oder spezifischen Wechselwirkungskräften
  • zwischen Enzymen und Substraten
  • zwischen Antikörpern und Antigenen
• Prinzip
  • Kovalente Fixierung von Liganden an Mikropartikel
  • Reversible Bindung der Analyten an den immobilisierten Liganden
  • Selektives Elutionsmittel trennt diese Bindung
• Beispiel
  • Selektive Trennung des Enzyms Peroxidase aus einem Proteingemisch
  • Spezielles Lectin (pflanzliches Protein) als Ligand fixiert an Kieselgel
  • Spezieller Zucker als selektiver Eluent 

• Verwendung eines chiralen chromatographischen Systems
• Varianten:
  • Mobile Phase chiral, stationäre Phase achiral (d.h. herkömmlich)
  • Stationäre Phase chiral, mobile Phase achiral
    • gebundene chirale feste Phase (bequem, aber sehr teuer)
    • flüssige stationäre Phase als Film auf einem Trägermaterial
• Prinzip
  • Bildung von diastereomeren Komplexen zwischen Analyt und mobiler oder stationärer Phase
  • → chromatographische Trennung möglich
• Beispiel
  • Bindung von Aminosäure-Kupfer-Verbindungen auf Silikagel (Proteinphasen) 

Bild