Biotechnologie 3.5
Eigenschaften von Plasmiden (wichtig für Klonierung), pBR322, pUC19, Selektion
Eigenschaften von Plasmiden (wichtig für Klonierung), pBR322, pUC19, Selektion
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Cartes-fiches
Eigenschaften von Plasmiden, die für eine Klonierung wichtig sind
- muss einen Replikationsstartpunkt (ori) besitzen (oft Bakterien spezifisch)
- RE-Schnittstellen besitzen, die jeweils nur 1x in Plasmid vorkommen dürfen
- muss DNA aufnehmen können (darf nicht zu groß sein)
- muss in die Bakterie eingebaut werden können
- geeignetes Selektionsmechanismus (z.B.: Antibiotikaresistenz-Gene)
Was wird in ein Plasmid eingebaut?
- weitere Resistenzgene oder andere Seliktionsmarker
- Polylinker = Multiple Klonierungsstellen
DNA-Sequenzen (künstlich hergestellt), die viele Re-Stellen von gängigen REs enthalten
pBR 322
- ca. 4,4 Kb groß (Klonierungskapazität ca. 6 Kb)
- 2 Antibiotika-Resistenzgene: AmpR, TetR (Ampicillin- & Tetracyclin-Resistenzgene
- mehrere RE-Schnittstellen, die nur 1x vorkommen (Pst I in AmpR, Bam HI in TetR)
- low copy-Plasmid, E.coli-ori
pUC 19
- ca. 2,7 Kb (Klonierungskapazität ca. 7,5 Kb)
- AmpR - Resistenzgen
- MKS in lacZ'-Gen
- high copy-Plasmid, E.coli-ori
3 Typen, die man nach einer DNA-Klonierung erhält
Welches Vektor und Klonierungsenzym hat man dafür verwendet?
- nicht transformierte Bakt. (ohne Plasmid): AmpS, TetS
- transformierte, nicht rekombinante Bakt. (mit Plsamid, ohne Insert): AmpR, TetR
- transformierte, rekombinante Bakt. (mit Plsamid, mit Insert): AmpR, TetS
Annahme: pBR 322 als Vektor, Klonierungsenzym Bam HI
Selektion bei Klonierung (pBR 322)
1. Transformationsansatz auf Medium mit Ampicilin ausplattieren
- nicht transformierte Bakt. sterben ab
- transfornierte Bakt. bilden Kolonien (einzelne K, Rest stirb ab)
2. Replikaplattierung auf Tetracyclin-haltiges (+Ampicillin) Medium
- rekombinante Bakt. können nicht überleben -> Ausfällen auf der Tet-Platte
3. Identifizierung d. rekombinanten Kolonien auf der Amp-Platte -> weitere Kolonien
Selektion bei Klonierung (pUC19)
1. Eigabe eines Inserts in die MKS führt zur Inaktivierung des lacZ'-Gens, das für eine Untereinheit des ß-Galactosidase codiert (Lactose -> Glucose + Galactose)
2. Selektionsmedium enthält neben Ampicillin auch noch x-Gal. : Farbstoff(x), gebunden an Galactose, x-Gal ist farblos, freies x ist blau
ITPS: dient als Induktor für das lacZ-Gen
- nicht rekombinante Kolonie: lacZ' wird abgelesen -> Bildung von ß-Galoctosidase -> spaltet x-Gal ab: blaue Kolonien
- rkombinante Kolonie: Insert ist in MKS in lacZ' eingefügt -> keine Bildung von ß-Galactosidase -> keine Abspaltung von x-Gal: weiße Kolonien
-> Blau-weiß-screening
Wichtig: REverdau + GE mit der rekom. Plasmiden -> muss mit dem Klonierungsenzym 2 Banden liefern: lineares Plasmid + Insert
Klonierungsschema
Einbringung von Fremd-DNA in ein Plasmid und Klonierung des rek. Vektorplasmids in E.coli
1. Vektorplasmid wird mit einem Restriktionsenzym, das nur in Polylinker schneidet, geöffnet (Restriktionsverdau). → klebrige Enden
2. Fremd-Gen wird mit dem gleichem RE (oder Isoschizomer) aus DNA-Verbund herausgeschnitten. → Insert hat gleiche klebrige Enden
3. Hybridisierung von Plasmid und Insert an den klebrigen Schnittstellen (Bildung von WBBs)
4. Verknüpfung der DNA-Fragmenten mit Ligase (Ligation) → rekombinante DNA
5. Transferierung des Vektorplasmids in eine Wirtszelle (E.coli)
6. Vermehrung der Bakterienzellen und des Plasmids → Klonierung der Fremd-DNA
7. evtl. Bildung eines rekombinanten Proteins.
