Biotechnologie 3.5

- weitere Resistenzgene oder andere Seliktionsmarker

- Polylinker = Multiple Klonierungsstellen

DNA-Sequenzen (künstlich hergestellt), die viele Re-Stellen von gängigen REs enthalten

- ca. 4,4 Kb groß (Klonierungskapazität ca. 6 Kb)

- 2 Antibiotika-Resistenzgene: Amp^R, Tet^R (Ampicillin- & Tetracyclin-Resistenzgene

- mehrere RE-Schnittstellen, die nur 1x vorkommen (Pst I in Amp^R, Bam HI in Tet^R)

- low copy-Plasmid, E.coli-ori

- ca. 2,7 Kb (Klonierungskapazität ca. 7,5 Kb)

- AmpR - Resistenzgen

- MKS in lacZ'-Gen

- high copy-Plasmid, E.coli-ori

- nicht transformierte Bakt. (ohne Plasmid): AmpS, TetS

- transformierte, nicht rekombinante Bakt. (mit Plsamid, ohne Insert): AmpR, TetR

- transformierte, rekombinante Bakt. (mit Plsamid, mit Insert): AmpR, TetS

Annahme: pBR 322 als Vektor, Klonierungsenzym Bam HI

1. Transformationsansatz auf Medium mit Ampicilin ausplattieren

- nicht transformierte Bakt. sterben ab

- transfornierte Bakt. bilden Kolonien (einzelne K, Rest stirb ab)

2. Replikaplattierung auf Tetracyclin-haltiges (+Ampicillin) Medium

- rekombinante Bakt. können nicht überleben -> Ausfällen auf der Tet-Platte

3. Identifizierung d. rekombinanten Kolonien auf der Amp-Platte -> weitere Kolonien

1. Eigabe eines Inserts in die MKS führt zur Inaktivierung des lacZ'-Gens, das für eine Untereinheit des ß-Galactosidase codiert (Lactose -> Glucose + Galactose)

2. Selektionsmedium enthält neben Ampicillin auch noch x-Gal. : Farbstoff(x), gebunden an Galactose, x-Gal ist farblos, freies x ist blau

ITPS: dient als Induktor für das lacZ-Gen

- nicht rekombinante Kolonie: lacZ' wird abgelesen -> Bildung von ß-Galoctosidase -> spaltet x-Gal ab: blaue Kolonien

- rkombinante Kolonie: Insert ist in MKS in lacZ' eingefügt -> keine  Bildung von ß-Galactosidase -> keine Abspaltung von x-Gal: weiße  Kolonien

-> Blau-weiß-screening

Wichtig: REverdau + GE mit der rekom. Plasmiden -> muss mit dem Klonierungsenzym 2 Banden liefern: lineares Plasmid + Insert

1. Vektorplasmid wird mit einem Restriktionsenzym, das nur in Polylinker schneidet, geöffnet (Restriktionsverdau). → klebrige Enden

2. Fremd-Gen wird mit dem gleichem RE (oder Isoschizomer) aus DNA-Verbund herausgeschnitten. → Insert hat gleiche klebrige Enden

3. Hybridisierung von Plasmid und Insert an den klebrigen Schnittstellen (Bildung von WBBs)

4. Verknüpfung der DNA-Fragmenten mit Ligase (Ligation) → rekombinante DNA

5. Transferierung des Vektorplasmids in eine Wirtszelle (E.coli)

6. Vermehrung der Bakterienzellen und des Plasmids → Klonierung der Fremd-DNA

7. evtl. Bildung eines rekombinanten Proteins.