Biochemie 6 - Proteine isolieren und charaktisieren
Aminosäuren, Proteinstruktur u. -eigenschaften, HPCL, SDS-PAGE
Aminosäuren, Proteinstruktur u. -eigenschaften, HPCL, SDS-PAGE
A1 Aminosäuren:
a) Welche zwei Aussagen über Leucin treffen nicht zu?
A1 Aminosäuren:
b) Erläutern Sie mit Hilfe einer Strukturzeichnung den Begriff alpha-Amino-Carbonsäure.
H2N-CHR-COOH
H2N => Amino-
CHR => alpha-C-Alom [Seitenkette hängt am ersten C-Atom hinter der Carbonsäure]
COOH => Carbonsäure
A2 Dünnschichtchromatographie:
a) Was versteht man unter dem Rf-Wert und welche Bedeutungs hat er für die Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren?
Rf= Laufstecke AS/ Laufstrecke Laufmittel
Der Rf-Wert ist ein relativer Vergleichswert der Laufstrecke in Abhängigkeit von der mobilen und stationären Phase. Mit ihm lassen sich Polaritäten vergleichen.
A2 Dünnschichtchromatographie:
b) In einer Dünnschichtchromatographie mit Kieselgel als stationäre Phase und einer apolaren mobilen Phase (pH 10) vergleichen Sie das Laufverhalten von Asparat, Alanin und Isoleucin.
Ordnen Sie folgene Rf-Werte je einer AS zu, begründen Sie Ihre Zuordnung: 0,45 - 0,12 - 0,59.
Asparat -> 0,12 -> Asp ist sehr polar (sauer) =>beide Carboxylgruppen + die Hälfte der Aminogruüppe dissoziieren; Asp hat somit eine hohe Affinität zum polaren Kieselgel => Konsequenz: läuft nicht sehr weit
Alanin -> 0,45 -> Ala ist eine unpolare aliphatische AS und hat keine hohe Affinität zur mobilen Phase => Konsequenz: läuft weiter, da von mobiler Phase getragen
Isoleucin -> 0,59 -> Iso. ist eine noch unpolareer aliphatische AS, da größere unpolare Seitenketten bestehen; es hat quasi keine Affinität zum Kieselgel => Konsequenz: läuft am weitesten
A2 Dünnschichtchromatographie:
c) Erläutern Sie die zwei Prinzipien, die zur Auftrennung von Substanzen (Analyten) durch chromatografische Verfähren führen.
Verteilung -> bestimmt durch die Löslichkeit des Stoffes in flüssiger, stationären Phase
Adsorbtion -> bestimmt durch die Affinität zur stationären Phase (Gegenprinzip -> Desorption)
A3 Proteinstruktur:
a) Beschreiben Sie drei Bindungstypen und die zugehörigen strukturbildenen Elemente der Tertiärstruktur.
- Disulfidbrücken: bei Cystein und Methionin (Schwefel im Rest)
- Ionenbindung: bei sauren und basischen Resten
- Van-der-Waals-Kräfte: hydrophobe WW bei unpolaren Resten (z.B. Leucin und Isoleucin oder aromatischen Systemen)
A3 Proteinstruktur:
b) Wie können diese Bindungen reversibel zerstört werden? Kurze Begründung!
- Disulfidbrücken durch Reduktionsmittel (z.B. beta-MercaptoEtOH) => reduziert Schwefelbindung
- Ionenbindung: extreme pH-Werte => Veränderung der Ladung der ionischen Reste
- Van-der-Waals-Kräfte: z.B. organische Lsg.-mittel => keine WW unter den unpolaren Resten sondern mit unpolaren Lsg.-mittel
A3 Proteinstruktur:
c) Nennen Sie ein Bsp. für eine kovalente Bindung als strukturbildenes Merkmal der Quatärstruktur und beschreiben Sie, wie diese chemisch zerstört werden kann.
Disulfidbrücken -> Zerstörung durch Reduktionsmittel (z.B. Dithiothreitol) => reduziert Schwefelbindung
A4 Proteine:
Welche zwei Aussagen zu den Säure/Base-Eigenschaften eines Proteins treffen zu:
A5 Chromatografie:
a) Beschreiben Sie die Eigenschaften der stationären und der mobilen Phase bei der Anionenaustauscher-Chromatografie und diskutieren Sie das Trennprinzip. (FACHBEGRIFFE!!)
stationäre Phase: positiv geladen, hohe Affinität bei Anionen => binden durch Adsorbtion an die Oberfläche (flüssig o. fest)
mobile Phase: Anionen enthaltende Lsg. (flüssig o. gasförmig), die mit aufsteigender Anionenkonz. dazugegeben wird:
- niedrige A.-konz. = nur Anionen mit geringer Affinität zur stat. Phase werden ausgetauscht und "durchgespült"
- hohe A.-konz. = auch Anionen mit hoher Affinität zur stat. Phase werden ausgetauscht
=> Größe und Stärke der Ionenladung sind ausschlaggebend für die Affinität eines Anions
A5 Chromatografie:
b) Was ist eine Retentionszeit? Bestimmen Sie aus der Grafik die RZ von Hb A und Hb S.
RZ = Zeit der Verzögerung im Durchlauf durch stationäre Phase
Hb A -> Peak bei 4,5 Min.
Hb S -> Peak bei 2,5 Min.
A5 Chromatografie:
c) Begründen Sie mit Hilfe des Chromatogramms die möglichen Unterschiede zwischen Hb S und Hb A. Nennen Sie ein Beispiel für einen passenden AS-Austauscher!
Hb S muss durch den AS-Austauscher eine Konformationsveränderung aufweisen, die mehr AS mit aromatischem Rest im inneren aufweist und somit eine nicht so starke Affinität zur stationären Phase hat wie Hb A.
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Cartes-fiches
A1 Aminosäuren:
a) Welche zwei Aussagen über Leucin treffen nicht zu?
A1 Aminosäuren:
b) Erläutern Sie mit Hilfe einer Strukturzeichnung den Begriff alpha-Amino-Carbonsäure.
H2N-CHR-COOH
H2N => Amino-
CHR => alpha-C-Alom [Seitenkette hängt am ersten C-Atom hinter der Carbonsäure]
COOH => Carbonsäure
A2 Dünnschichtchromatographie:
a) Was versteht man unter dem Rf-Wert und welche Bedeutungs hat er für die Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren?
Rf= Laufstecke AS/ Laufstrecke Laufmittel
Der Rf-Wert ist ein relativer Vergleichswert der Laufstrecke in Abhängigkeit von der mobilen und stationären Phase. Mit ihm lassen sich Polaritäten vergleichen.
A2 Dünnschichtchromatographie:
b) In einer Dünnschichtchromatographie mit Kieselgel als stationäre Phase und einer apolaren mobilen Phase (pH 10) vergleichen Sie das Laufverhalten von Asparat, Alanin und Isoleucin.
Ordnen Sie folgene Rf-Werte je einer AS zu, begründen Sie Ihre Zuordnung: 0,45 - 0,12 - 0,59.
Asparat -> 0,12 -> Asp ist sehr polar (sauer) =>beide Carboxylgruppen + die Hälfte der Aminogruüppe dissoziieren; Asp hat somit eine hohe Affinität zum polaren Kieselgel => Konsequenz: läuft nicht sehr weit
Alanin -> 0,45 -> Ala ist eine unpolare aliphatische AS und hat keine hohe Affinität zur mobilen Phase => Konsequenz: läuft weiter, da von mobiler Phase getragen
Isoleucin -> 0,59 -> Iso. ist eine noch unpolareer aliphatische AS, da größere unpolare Seitenketten bestehen; es hat quasi keine Affinität zum Kieselgel => Konsequenz: läuft am weitesten
A2 Dünnschichtchromatographie:
c) Erläutern Sie die zwei Prinzipien, die zur Auftrennung von Substanzen (Analyten) durch chromatografische Verfähren führen.
Verteilung -> bestimmt durch die Löslichkeit des Stoffes in flüssiger, stationären Phase
Adsorbtion -> bestimmt durch die Affinität zur stationären Phase (Gegenprinzip -> Desorption)
A3 Proteinstruktur:
a) Beschreiben Sie drei Bindungstypen und die zugehörigen strukturbildenen Elemente der Tertiärstruktur.
- Disulfidbrücken: bei Cystein und Methionin (Schwefel im Rest)
- Ionenbindung: bei sauren und basischen Resten
- Van-der-Waals-Kräfte: hydrophobe WW bei unpolaren Resten (z.B. Leucin und Isoleucin oder aromatischen Systemen)
A3 Proteinstruktur:
b) Wie können diese Bindungen reversibel zerstört werden? Kurze Begründung!
- Disulfidbrücken durch Reduktionsmittel (z.B. beta-MercaptoEtOH) => reduziert Schwefelbindung
- Ionenbindung: extreme pH-Werte => Veränderung der Ladung der ionischen Reste
- Van-der-Waals-Kräfte: z.B. organische Lsg.-mittel => keine WW unter den unpolaren Resten sondern mit unpolaren Lsg.-mittel
A3 Proteinstruktur:
c) Nennen Sie ein Bsp. für eine kovalente Bindung als strukturbildenes Merkmal der Quatärstruktur und beschreiben Sie, wie diese chemisch zerstört werden kann.
Disulfidbrücken -> Zerstörung durch Reduktionsmittel (z.B. Dithiothreitol) => reduziert Schwefelbindung
A4 Proteine:
Welche zwei Aussagen zu den Säure/Base-Eigenschaften eines Proteins treffen zu:
A5 Chromatografie:
a) Beschreiben Sie die Eigenschaften der stationären und der mobilen Phase bei der Anionenaustauscher-Chromatografie und diskutieren Sie das Trennprinzip. (FACHBEGRIFFE!!)
stationäre Phase: positiv geladen, hohe Affinität bei Anionen => binden durch Adsorbtion an die Oberfläche (flüssig o. fest)
mobile Phase: Anionen enthaltende Lsg. (flüssig o. gasförmig), die mit aufsteigender Anionenkonz. dazugegeben wird:
- niedrige A.-konz. = nur Anionen mit geringer Affinität zur stat. Phase werden ausgetauscht und "durchgespült"
- hohe A.-konz. = auch Anionen mit hoher Affinität zur stat. Phase werden ausgetauscht
=> Größe und Stärke der Ionenladung sind ausschlaggebend für die Affinität eines Anions
A5 Chromatografie:
b) Was ist eine Retentionszeit? Bestimmen Sie aus der Grafik die RZ von Hb A und Hb S.
RZ = Zeit der Verzögerung im Durchlauf durch stationäre Phase
Hb A -> Peak bei 4,5 Min.
Hb S -> Peak bei 2,5 Min.
A5 Chromatografie:
c) Begründen Sie mit Hilfe des Chromatogramms die möglichen Unterschiede zwischen Hb S und Hb A. Nennen Sie ein Beispiel für einen passenden AS-Austauscher!
Hb S muss durch den AS-Austauscher eine Konformationsveränderung aufweisen, die mehr AS mit aromatischem Rest im inneren aufweist und somit eine nicht so starke Affinität zur stationären Phase hat wie Hb A.
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