BATL
Aufarbeitungstechnik Praktikum
Aufarbeitungstechnik Praktikum
Fichier Détails
| Cartes-fiches | 81 |
|---|---|
| Langue | Deutsch |
| Catégorie | Technique |
| Niveau | École primaire |
| Crée / Actualisé | 24.11.2013 / 09.12.2013 |
| Lien de web |
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| Intégrer |
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Unter welchen Bedingungen geht das Protein in die org. Phase über?
Skizzieren Sie einen Tellerseperator für die Flüssig-Flüssig-Trennung mit Tellersatz und Strömungsprofil.
wässriges 2-Phasen-Gemisch
Steigkanal
radial angeordnete Rippen
Separierungsraum
Abflus leichte und schwere Phase
Was kann man prinzipiell tun, wenn die TOP-Phase mit 20% BOT-Phase verunreinigt ist? (2 Lösungsvorschläge)
- verwendung einer größeren Düse
- versetzen der Steigkanäle weiter nach Außen
Welche theoretischen Möglichkeiten bestehen, die Trenneigenschaften im Seperator zu beeinflussen?
variieren:
- des Volumenstroms
- der Düsenlänge
- der Drehzahl
- des Abstandes der Teller zueinander
- der Lage der Steigkanäle
Erläutern Sie das Trennprinzip einer Trenntrommel.
Durch die Drehung des Tellerseperators wird die BOT-Phase nach Außen gedrückt und die TOP-Phase nach Innen. Die eigentliche Auftrennung erfolgt auf den Tellerstufen, hier steigen beide Phasen durch die Steigkanäle nach oben. Dort verteilen sich die Phasen dann entsprechend nach Innen oder Außen entlang der Teller. Durch getrennte Ausgänge erhält man eine TOP und eine BOT-Phase. Vorraussetzung für die Trennung ist der richtige Staudruck und die position der Steiglöcher (abhängig von der Zusammensetztung des Homogenats).
Begründen Sie, warum bei der Anionenaustauschersäule der Aufreinigungsfaktor für Gl-6-P-DH größer sein muss als für die Fumarase, die bereits mit der Waschfraktion durchlief?
In der Fumarase-Fraktion befinden sich auch alle anderen Proteine, die nicht von der Säule gebunden wurden, während in der Gl-6-P-DH-Fraktion nach möglichkeit nur das Enzym vorliegt. Damit ist das gebundene Enzym reiner als das Enzym das nicht an der Säule gebunden wurde.
Definieren sie den Begriff Flux und ordenen Sie diesen einer Aufarbeitungsmethode zu.
Flux = Volumenstrom pro Fläsche [m³/Lxh]
=> Diafiltration
Definieren sie den Begriff lineare Flussrate und ordenen Sie diesen einer Aufarbeitungsmethode zu.
lineare Flussrate = Volumenstrom pro Querschnittsfläsche der Säule [cm/h]
=> Chromatographie
Definieren sie den Begriff Eluationsvolumen und ordenen Sie diesen einer Aufarbeitungsmethode zu.
Eluationsvolumen = von Anfang des Volumens bis zum erreichen der Peakmitte -> V od. t gegen OD aufgetragen
=> Chromatographie
Definieren sie den Begriff Verteilungskoeffizient und ordenen Sie diesen einer Aufarbeitungsmethode zu.
Verteilungskoeffizient K = U/mL TOP pro U/mL BOT
=> 2-Phasensystem
Definieren sie den Begriff Aufreinigungsfaktor und ordenen Sie diesen einer Aufarbeitungsmethode zu.
Aufreinigungsfaktor = spez. Akt. Ist pro spez. Akt. Homogenat
=> Enzymaktivitätsbestimmung z.B. einer Fraktion aus einer Chromatographie
Stellen Sie 20 L einer 0,025 M K-Phosphatlösung mit einem pH = 7,5 aus einer 1 M Stammlösung her. Wie viel Liter Stammlösung werden benötigt?
0,5 L
Wenn der pH-Wert eines KHPO4-Puffers nur 7,0 betragen soll, statt 7,5 muss welcher Anteil an Phosphat in der Stammlösung erhöht werden (Warum)?
Der Anteil an KH2PO4 muss erhöht werden, da der pH abgesenkt werden soll. Denn KH2PO4 ist der saure Anteil im Puffer, während K2HPO4 der basische Anteil im Puffer ist.
Erklären Sie die prinzipiellen Vorgänge beim Flocken von Hefezellen mit Kalkmilch. Welches Gesetzt kommt zur Anwendung?
Hefezellen tragen eine negative Oberfläschenladung, die von der Dissoziation der Carboxylgruppen der Zellwandproteine bei physiologischen pH-Wert herrühren. Wird Kalkmilch (Ca²) als Flockungsmittel eingesetzt, so wird die negative Ladung der Zellen neutralisiert. Bei einer bestimmten Ca²-Konzentration, stoßen die Zellen, die nunmehr ihre negative Ladung verloren haben, sich nicht mehr ab. Sie treten mit benachbarten Zellen in Kontakt (Agglomerate) und sedimentieren.
Gesetz: Stok´sche Gesetz
Warum können sich die Flocken wieder lösen, wenn der Kalkmilchanteil zu hoch ist?
Warum wird praktisch das Auflösen nicht oder kaum beobachtet?
Ist die Ca²-Konzentration zu hoch, so überziehen sich die Hefezellen mit einer positiven Ladung und stoßen sich somit wieder ab. Die Agglomerate lösen sich wieder auf und erzeugen wieder eine Trübung im Überstand.
Ca²-Ionen bilden zusätzlich Hydrokoloide, also selbst diskrete Teilchen, so sedimentieren diese Agglomerate und reißen dabei Zellen aus der Umgebung mit. Durch diesen Einfluss wird die Sedimentationsgeschwindigkeit der Hefezellen erhöht. Hydrokolloide werden durch Neutralisation der CaCl2-Lösung, in unseren Fall durch die Zugabe von KPi-Puffer hergestellt. Die mehr oder weniger klare CaCl2-Lösung wird durch Ausflocken der Hydrokolloide trüb.
Bei welchen Parametern wird die Proteinbestimmung durchgeführt?
- Wellenlänge bei 595 nm
- Reagenz Bradford mit Coomassie Blue G250
- Raumtemperatur
- Zeitfaktor 2 min Inkubation + 30 min stabil
- Halbmikroplastikküvette
- Zentrifugation trüber Substanzen
- Messen gegen Wasser
- Verdünnung Testbereich: 0,2 - 0,8 mg/mL
Proteinbestimmung: Welche Einheiten werden für die Eichkurve aufgetragen?
BSA-Konzentration [µg/100 µL] gegen Extinktion bei 595 nm
Proteinbestimmung: Warum wird jeden Tag die Eichkurve neu ermittelt?
Alterung des Bradford-Reagenzes bedingt Zunahme des Blindwertes, durch Erhöhung der Eigenextinktion.
-> tägliches filtrieren + Eichkurve erstellen um Fehler zu kompensieren
Proteinbestimmung: Warum geht die Eichgerade nicht durch den Nullpunkt?
Es wird gegen Wasser abgeglichen und es besitzt eine Eigenextinktion von ca. 0,28 Absorptionseinheiten.
Wie lautet die Formel zur Proteinbestimmung?
(µg/100 µL x Faktor x Verdünnung)/1000 = [mg/mL]
Erläutern sie die Formel zur Berechnung des Proteingehaltes unter Nutzung der Eichkurve.
Eichkurve = Standard-Konzentration gegen Extinktion [µg/100 µL]
Faktor = Umrechnung 100 µL in 1 mL
1000 = Umrechnung µg in mg
Verdünnung 1:50 = 50
Proteinbestimmung: Wie ist eine Verdünnung sinnvoll vorzunehmen, wenn eine Verdünnung von 1:100 benötigt wird?
Nach welchem Prinzip funktioniert die Proteinbestimmung nach Bradford mit Coomassie Blue G250?
Bindung des Farbstoffes ans Protein durch ionische und hydrophobe WW.
Folge: Verschiebung des Absorptionsmaximum von 465 nm nach 595 nm.
Nennen sie die chemische Formel der Fumarase-Reaktion.
Malat + Fumarase -> Fumarat + Wasser
Welches Reagenz wird zur Fumaraseaktivitäts-Bbestimmung eingesetzt?
L-Malat + Dikaliumphosphat-Lösung
Welche Wellenlänge wird bei der Bestimmung der Fumaraseaktivität verwendet?
250 nm
Wie lautet die Formel zur Bestimmung der volumetrischen Aktivität?
(Gesamtvolumen [mL] x Verdünnung)/(e [cm²/µmol] x enzym [mL] x d [cm]) x deltaE [L/min] = [U/mL]
Erläutern Sie die wesentliche Wirkung vom Einsalzen bei der Proteingewinnung.
NaCl zerfällt in wässriger Lösung in die einzelnen Ionen Na+ u. Cl-, die an neg. u. pos. geladenen Regionen des Enzyms binden.
Mit anlagern der großen Hydrathülle um Löslichkeit in salzhaltigen Phase zu optimieren.
Erläutern Sie die wesentliche Wirkung des Aussalzens.
Amoniumsulfatfällung
Ladung und Ionen bewirken Ausbildung der Tertiärstruktur + WW mit dem umgebenden Lösungsmittel
-> Zugabe von Salz bewirkt eine Konkurrenz zwischen dem durch das Salzion gebundenes Wasser und der Hydrathülle um das Protein
-> somit können Proteine zwischen unterschiedlichen Molekülen direkt interagieren -> Präzipitation
Wie kann die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante k bei der RWKM ermittelt werden?
über N (Passagen) = (Volumenstrom/Ausgangsvolumen) x t
ln (Rm/ Rm-R) = k x N
Auftragung ln (Rm/Rm-R) gegen N -> Steigung = k
Rm = max Aufschlussgrad (100%)
R = Ist-Aufschlussgrad
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