Bakteriengenetik Teil 3

• Klasse II-Tn (einfaches Tn)
• Klasse I-Tn (zusammengesetztes Tn)

Ein denkbarer Weg wäre, dass das Transposon in das Plasmid eines Bakteriums inseriert. 
Nachdem das Plasmid auf ein anderes Bakterium übertragen wurde, kann das Transopson 
wieder aus dem Plasmid in das Bakteriengenom springen.  
Ein weiterer Weg ist, dass das Transposon zusammen mit einem Teil des 
Bakteriengenoms eines Hfr-Stammes übertragen wird. Auch denkbar wäre eine 
Übertragung mittels Transduktion, indem ein Stück bakterieller DNA, welche das 
Transposon enthält, zufällig in einen Phagen verpackt wird und dieser Phage dann ein 
anderes Bakterium infiziert. Durch homologe Rekombination kann das Transposon dann 
in das bakterielle Genom des Rezipienten integriert werden.  

Transposons von Bakterien enthalten meistens Gene, die eine Antibiotikaresistenz vermitteln. Sie 
können vom Bakterienchromosom auch auf Plasmide übertragen werden und zwischen diesen 
ringförmigen DNA-Molekülen weitergegeben werden; auf diese Weise ist die Entstehung neuer 
Resistenzplasmide möglich. Transposons können so auch zwischen einzelnen Zellen übertragen 
werden. Man unterscheidet zwischen einfachen T. (Klasse II-T.) wie Tn3 (Ampicillinresistenz), 
zusammengesetzten T. (Klasse I-T.) wie Tn5 (Kanamycinresistenz) und Tn9 
(Chloramphenicolresistenz), bei denen ein Gen von zwei Insertionssequenzen (IS) flankiert wird, und 
transponierbaren Phagen, die sich wie der Phage Mu nicht nur in die DNA der Wirtszelle integrieren, 
sondern auch innerhalb dieser bewegen können. 

Während Cut&Paste-Transposons auch nach der Transposition eine konstanter Kopienzahl aufweisen, vermehren sich replikative Transposons mit jeder Transpositon. Man könnte zum Beispiel die Transposition in einem Bakterium induzieren. Nachdem die Transposition verlaufen ist, kann das Bakteriengenom mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden, welches keine Schnittstellen innerhalb des Transposons aufweist. Anschließend können die Fragmente der Länge nach aufgetrennt werden, zum Beispiel 
durch eine Gelelektrophorese. Die Fragmente werden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und in einem Southern-Blot mit einer Sonde die komplementär zu dem Transposon ist wird die Zahl der Transposons und deren Auftreten in den unterschiedlich langen Fragmenten untersucht. Wenn die Zahl der nachgewiesenen Transposons gleich bleibt und sich nur die Länge der Fragmente in denen sie sich befinden ändert, hat das Transposon einen Cut&Paste-Mechanismus. Treten mehr Transposons als ursprünglich auf, handelt es sich um einen replikativen Mechanismus. 

Eine weitere Methode zur Unterscheidung der Mechanismen ist, dass bei replikativer Transposition nur ein Strang der jeweiligen DNA übertragen wird, bei Cut&Paste aber beide. Entsprechend wird ein Transposon erzeugt, dessen beide DNA-Stränge sich unterscheiden: zum Beispiel indem ein Strang das LacZ+-Gen enthält, der andere das LacZ-Gen. Es wird ein Heteroduplex aus den Strängen erzeugt, in Phagen gepackt und Bakterien damit infiziert. Da es sich hierbei um Suicide-Vektoren handelt, können nur solche Bakterien die im Transposon orhandene Resistenz nutzen, wenn das Transposon gesprungen ist in das Bakteriengenom. Handelt es sich um Cut&Paste-Transposition, dann werden die beiden Stränge übertragen, und bei einer eventuellen Replikation erhält eine Tochterzelle das intakte Gen, die andere das  nicht funktionelle. Die entstehenden Kolonien sind teils blau, teils weiß. Bei replikativer Transposition wird nut ein Strang übertragen, der jeweils fehlende Strang wird durch Replikation ersetzt. In diesem Fall würden die Bakterien entweder nur LacZ+ oder LacZ-Gene enthalten, sodass die entstehenden Kolonien entweder nur blau oder nur weiß sind.

• Einige Transposons tragen Gene, die dem Wirtsbakterium Vorteile bringen, wie zum Beispiel Antibiotikaresistenzen oder andere vorteilhafte Gene. Transposons helfen dem Wirtsbakterium auch, Gene zu verschieben, wodurch zum Beispiel Plasmide mit multiplen Resistenzen entstehen können. Außerdem können Transposons Gene abschalten, indem sie in funktionsfähige Gene insertieren. Das kann sowohl ein Vor- als auch ein Nachteil sein.
• Der offensichtliche Nachteil von Transposons ist, dass sie wichtige Gene schädigen können, indem sie deren Sequenz verändern oder in die regulativen Elemente eingreifen. Wenn die schädlichen Effekte der Transposons überhand nehmen, stirbt der Wirtsorganismus jedoch, sodass gegen zu viele Transposons in einem einzelnen Organismus selektioniert wird. 

Es wird ein Southern Blot durchgeführt, der die Sequenz innerhalb des Transposons 
nachweist. Dafür werden Bakterienstämme isoliert, in denen das Transposon unabhängig 
voneinander inseriert wurde. Die DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease 
geschnitten, die keine Schnittstelle innerhalb des Transposons hat. Wenn für jeden Stamm 
unterschiedlich lange Fragmente entstehen, dann sind die Fragmente in denen das 
Transposon liegt alle verschieden voneinander, und das Transposon inseriert zufällig. 

Man könnte ein Plasmid konstruieren, das zwei Kopien des Mu-Phagen enthält, indem ein 
Stück der DNA der Mu enthält in ein Plasmid kloniert wird, das bereits den Mu-Phagen 
enthält. Dann muss herausgefunden werden, ob die zwei wiederholten Mu-Elemente sich 
resolvieren können, wenn keine Rekombinationsfaktoren des Wirts vorhanden sind. 

Zuerst muss eine Library der DNA des entsprechenden Stamms in ein Plasmid kloniert 
werden. Dieses Plasmid muss eine breite host-range haben und mobilisierbar sein, wie 
zum Beispiel das Plasmid RSF1010. Die Plasmid-Library wird in Mutanten mobilisiert, 
die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure nicht verstoffwechseln können, da das Gen hierfür 
mittels eines Transposons inaktiviert wurde. Es werden solche Stämme selektiert, die auf 
einem Minimalmedium mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure als einziger Kohlenstoffquelle 
wachsen können. Der Plasmidklonierungsvektor in den Bakterien, die Kolonien formen 
können, sollten das Gen enthalten, das mutiert wurde um das Wachstum auf 2,4-
Dichlorphenoxyessigsäure zu verhindern, und das Plasmidgen komplementiert die 
Mutation auf dem Bakteriengenom. 

• Zum einen inaktivieren Transposons die Gene beinahe immer, und sie sind nicht „leaky“, das heißt dass die Gene vollständig abgeschaltet werden und der Phänotyp der Nullmutante bestimmt werden kann. Außerdem markieren sie die Stelle der Mutation sowohl genetisch als auch physikalisch. Dadurch kann die Site der Mutation leicht durch genetische oder physikalische Kartierungstechniken bestimmt werden.  
• Der Nachteil ist, dass diese Mutationen die Gene praktisch immer inaktivieren, sodass der Effekt von anderen Mutationen auf die Gene nicht untersucht werden kann. Auch sind Insertionen von Transposons in essentielle Gene in haploiden Organismen nicht möglich, weil diese sonst letal wirken.  

• temperenter Virus, hat Eigenschaft sich als transponierbares Element zu replizieren 
• Mu von Mutatorphage, induziert Mutationen im Wirtsgenom, in das er integriert wird 
• Mu inaktiviert Wirtsgene -> kann Mutantenphänotyp zeigen 
• Kann auf leichte Art und Weise eine große Vielzahl von Bakterienmutanten erzeugen 
• Mu ist also gleichzeitig ein großes Transposon und ein bakterienbefallendes Virus, das seine DNS 
• durch Transposition repliziert. 
• Genom von Mu besteht aus linearer, doppelsträngiger DNS  
• 39 Kbp misst das genom, aber nur 37,2 Kbp sind egtl genom, dies kommt daher, dass beide Enden 
• von Mu aus WirtsDNA bestehen 

Die Lokalisierung des Ortes einer Transposition innerhalb eines Plasmids ist relativ einfach. 
Da das Plasmid unweigerlich auch neue Restriktionsschnittstellen in das Plasmid einführt, 
kann man es unter deren Verwendung auch untersuchen. Man wählt zwei 
Restriktionsendonucleasen, die sowohl das Plasmid als auch das Transposon schneiden. 
Einige Fragmente haben dabei immer die gleiche Länge, unabhängig davon, wo das 
Transposon in das Plasmid integriert wurde. Es handelt sich dabei um interne Fragmente, die 
im Inneren des Transposons liegen. Die andere Fragmente ändern jedoch ihre Länge, je 
nachdem wo das Transposon sich in dem Plasmid befindet. Die Fragmente zwischen einer 
Schnittstelle auf dem Plasmid und einer auf dem Transposon, die so genannten Junction 
Fragmente, ändern sich je nach Integrationsort des Transposons. Wenn die Größe des 
Plasmids und des Transposons bekannt sind, kann daraus errechnet werden, an welcher 
Position das Transposon in das Plasmid eingesetzt wurde. Die Längen der jeweiligen 
Fragmente wird mittels einer Gelelektrophorese bestimmt. Die beiden Restriktionsenzyme 
werden unabhängig voneinandereingesetzt, und auf dem Gel wird ein Längenstandard 
eingesetzt, um die Länge der Fragmente abschätzen zu können.

Phagen Bank: schnell, effizient, Cosmid (zu groß um in Zelle zu transformieren) 
Cosmid Vektoren:            Vorteil: können längere Inserts aufnehmen, < ca. 40-50 kbp, dh. 3 x so lange 
Inserts wie ein Phagenvektor.