Bakteriengenetik Teil 3

• mobile DNA Partikel die nicht unabhängig die Wirtszelle verlassen können
• Hüpfen oder transpose von einem Ort in der DNA zum nächsten
• Größe: einige 100-10^4 bp
• Präsent in mehreren Kopien pro Zelle
• codieren Transposase
• können auch Resistenzen oder zusätzliche Gene kodieren
• VOr- und Nachteile für Wirt

• Klasse II-Tn (einfaches Tn)
• Klasse I-Tn (zusammengesetztes Tn)

Ein denkbarer Weg wäre, dass das Transposon in das Plasmid eines Bakteriums inseriert. 
Nachdem das Plasmid auf ein anderes Bakterium übertragen wurde, kann das Transopson 
wieder aus dem Plasmid in das Bakteriengenom springen.  
Ein weiterer Weg ist, dass das Transposon zusammen mit einem Teil des 
Bakteriengenoms eines Hfr-Stammes übertragen wird. Auch denkbar wäre eine 
Übertragung mittels Transduktion, indem ein Stück bakterieller DNA, welche das 
Transposon enthält, zufällig in einen Phagen verpackt wird und dieser Phage dann ein 
anderes Bakterium infiziert. Durch homologe Rekombination kann das Transposon dann 
in das bakterielle Genom des Rezipienten integriert werden.  

Transposons von Bakterien enthalten meistens Gene, die eine Antibiotikaresistenz vermitteln. Sie 
können vom Bakterienchromosom auch auf Plasmide übertragen werden und zwischen diesen 
ringförmigen DNA-Molekülen weitergegeben werden; auf diese Weise ist die Entstehung neuer 
Resistenzplasmide möglich. Transposons können so auch zwischen einzelnen Zellen übertragen 
werden. Man unterscheidet zwischen einfachen T. (Klasse II-T.) wie Tn3 (Ampicillinresistenz), 
zusammengesetzten T. (Klasse I-T.) wie Tn5 (Kanamycinresistenz) und Tn9 
(Chloramphenicolresistenz), bei denen ein Gen von zwei Insertionssequenzen (IS) flankiert wird, und 
transponierbaren Phagen, die sich wie der Phage Mu nicht nur in die DNA der Wirtszelle integrieren, 
sondern auch innerhalb dieser bewegen können. 

Während Cut&Paste-Transposons auch nach der Transposition eine konstanter Kopienzahl aufweisen, vermehren sich replikative Transposons mit jeder Transpositon. Man könnte zum Beispiel die Transposition in einem Bakterium induzieren. Nachdem die Transposition verlaufen ist, kann das Bakteriengenom mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden, welches keine Schnittstellen innerhalb des Transposons aufweist. Anschließend können die Fragmente der Länge nach aufgetrennt werden, zum Beispiel 
durch eine Gelelektrophorese. Die Fragmente werden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und in einem Southern-Blot mit einer Sonde die komplementär zu dem Transposon ist wird die Zahl der Transposons und deren Auftreten in den unterschiedlich langen Fragmenten untersucht. Wenn die Zahl der nachgewiesenen Transposons gleich bleibt und sich nur die Länge der Fragmente in denen sie sich befinden ändert, hat das Transposon einen Cut&Paste-Mechanismus. Treten mehr Transposons als ursprünglich auf, handelt es sich um einen replikativen Mechanismus. 

Eine weitere Methode zur Unterscheidung der Mechanismen ist, dass bei replikativer Transposition nur ein Strang der jeweiligen DNA übertragen wird, bei Cut&Paste aber beide. Entsprechend wird ein Transposon erzeugt, dessen beide DNA-Stränge sich unterscheiden: zum Beispiel indem ein Strang das LacZ+-Gen enthält, der andere das LacZ-Gen. Es wird ein Heteroduplex aus den Strängen erzeugt, in Phagen gepackt und Bakterien damit infiziert. Da es sich hierbei um Suicide-Vektoren handelt, können nur solche Bakterien die im Transposon orhandene Resistenz nutzen, wenn das Transposon gesprungen ist in das Bakteriengenom. Handelt es sich um Cut&Paste-Transposition, dann werden die beiden Stränge übertragen, und bei einer eventuellen Replikation erhält eine Tochterzelle das intakte Gen, die andere das  nicht funktionelle. Die entstehenden Kolonien sind teils blau, teils weiß. Bei replikativer Transposition wird nut ein Strang übertragen, der jeweils fehlende Strang wird durch Replikation ersetzt. In diesem Fall würden die Bakterien entweder nur LacZ+ oder LacZ-Gene enthalten, sodass die entstehenden Kolonien entweder nur blau oder nur weiß sind.

• Einige Transposons tragen Gene, die dem Wirtsbakterium Vorteile bringen, wie zum Beispiel Antibiotikaresistenzen oder andere vorteilhafte Gene. Transposons helfen dem Wirtsbakterium auch, Gene zu verschieben, wodurch zum Beispiel Plasmide mit multiplen Resistenzen entstehen können. Außerdem können Transposons Gene abschalten, indem sie in funktionsfähige Gene insertieren. Das kann sowohl ein Vor- als auch ein Nachteil sein.
• Der offensichtliche Nachteil von Transposons ist, dass sie wichtige Gene schädigen können, indem sie deren Sequenz verändern oder in die regulativen Elemente eingreifen. Wenn die schädlichen Effekte der Transposons überhand nehmen, stirbt der Wirtsorganismus jedoch, sodass gegen zu viele Transposons in einem einzelnen Organismus selektioniert wird. 

Es wird ein Southern Blot durchgeführt, der die Sequenz innerhalb des Transposons 
nachweist. Dafür werden Bakterienstämme isoliert, in denen das Transposon unabhängig 
voneinander inseriert wurde. Die DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease 
geschnitten, die keine Schnittstelle innerhalb des Transposons hat. Wenn für jeden Stamm 
unterschiedlich lange Fragmente entstehen, dann sind die Fragmente in denen das 
Transposon liegt alle verschieden voneinander, und das Transposon inseriert zufällig. 

Man könnte ein Plasmid konstruieren, das zwei Kopien des Mu-Phagen enthält, indem ein 
Stück der DNA der Mu enthält in ein Plasmid kloniert wird, das bereits den Mu-Phagen 
enthält. Dann muss herausgefunden werden, ob die zwei wiederholten Mu-Elemente sich 
resolvieren können, wenn keine Rekombinationsfaktoren des Wirts vorhanden sind. 

Zuerst muss eine Library der DNA des entsprechenden Stamms in ein Plasmid kloniert 
werden. Dieses Plasmid muss eine breite host-range haben und mobilisierbar sein, wie 
zum Beispiel das Plasmid RSF1010. Die Plasmid-Library wird in Mutanten mobilisiert, 
die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure nicht verstoffwechseln können, da das Gen hierfür 
mittels eines Transposons inaktiviert wurde. Es werden solche Stämme selektiert, die auf 
einem Minimalmedium mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure als einziger Kohlenstoffquelle 
wachsen können. Der Plasmidklonierungsvektor in den Bakterien, die Kolonien formen 
können, sollten das Gen enthalten, das mutiert wurde um das Wachstum auf 2,4-
Dichlorphenoxyessigsäure zu verhindern, und das Plasmidgen komplementiert die 
Mutation auf dem Bakteriengenom.