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• Disulfidbrückenbildungen im Periplasma Proteine mit stabilen Disulfidbindungen in den oxidierten Bereichen

• bei E.coli: ist das Periplamsa der Bereich für die Disuldidbrückenbildung (Dsb)

• viele Proteine benötigen Disulfidbrücken für eine korrekte Faltung

• Disulfidbrückenbindungen sind in unterschiedliche Reaktionswege involviert:

1. Oxidation (DsbA und DsbB)

2. Isomerisation (DsbC, DsbD)

3. Reduktion von Sulfensäuren (DsbG, DsbD); neu beschrieben

4. Reduktion von Methioninsulfoxid (MsrAB-Trx; DsbD); neu beschrieben

= Cluster-basierter Sensor

• Aconitasen sind Fe-S Proteine, welche die Umwandlung von Citrat in Isocitrat innerhalb des TCA-Zyklus katalysieren

• können aber auch Sensoren für oxidativen Stress uns Eisenmangel sein

• unter Eisenmangel oder oxidativem Stress wird das [4Fe-4S] Cluster zerstört und das Enzym verliert seine katalytische Aktivität

• das resultierende Apo-Protein kann spezifisch an mRNAs binden und so als Post-Transkriptionaler Regulator fungieren; die mRNA-Bindestellen werden als „iron responsiv elements“ (ihres) bezeichnet

• ihres sind sogenannte Stem-Ioop-Strukturen, welche sich durch Rückfaltung palindromer Sequenzen bilden

• die Bindung von Aconitase kann die mRNA stabilisieren oder eine Translation verhindern

ArcBA (= Chinon-basierter Sensor für O2)

• Das ArcBA Zweikomponenten-Regulationssystem ist ein globaler Regulator der Genexpression unter mikroaeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen.

• In Abwesenheit von O2 wird ArcB an einem Histidin in der Transmitter-Domäne autophosphoryliert und überträgt den P-Rest über eine Kaskade auf den DNA-bindenden Response-Regulator ArcA

• ArcA~P reprimiert die Expression der terminalen Cytochrome o Oxidase, von TCA zyklus enzymen und Dehydrogenasen für das aerobe Wachstum (PDH) und aktiviert die Expression der O2-affineren terminalen Cytochrome d Oxidase

• ArcB detektiert nicht direkt O2, sondern den Redox-Status des Chinon-Pools der Atmungskette; Redox-Sensoren können also auch den Redox-Status des Chinon-Pools der Zelle messen, was zur Inaktivierung durch O2 führt (ArcB)

• die Aktivierung von ArcB erfolgt durch die Reduktion intermolekuarer Disulfidbrücken

FNR (= Regulator of fumarate-nitrate-respiration: Cluster-basierter Sensor)

• Das Fe-S Protein FNR von E. coli ist ein direkter Sensor von O2

• Unter anaeroben Verhältnissen bewirkt FNR die Expression alternativer Elektronenakzeptoren (anaerobe Respiration)

• FNR besteht aus 2 Domänen: einer N-terminalen sensorischen Domäne und einer C-terminalen DNA-Bindedomäne

• Unter anaeroben Bedingungen koordiniert die N-terminale Domäne ein [4Fe-4S] Cluster und bildet einen homodimeren Komplex

• Unter aeroben Bedingungen wird dieses Cluster zunächst in ein [2Fe-2S] Cluster und anschließend in das Apo-Protein überführt

• Dadurch wird FNR unter aeroben Bedingungen inaktiviert

S-Thiolierungen: Redoxpuffer werden oxidiert, um die Reduktion der Proteine aufrecht zu erhalten

S-Glutathionylierung in E. coli und Eukaryoten (gr-):

Funktionen:

• Co-Faktor für Glyoxalase
• Entgiftungsmittel
• Reduktion von Disulfidbrücken

beseitigt durch:

• Peroxidase und Reduktase
• Glutatredoxin
• Glutathion-Disulfid-Reduktase

S-Bacillithiolierung in Bacillus und Staphylococcus (gr+):

(Brx = Bacilliredoxin; reduziert S-Bacillithiolierte Proteine)

(Bdr = Bacillithiol-Disulfid-Reduktase; reduziert BSSB (ist die ox. Form))

Funktionen:

• entgiftet Antibiotika-Toxine
• bildet Co-Faktor zur Entgiftung von ROS/ RES (Proteinschutz)
• Fosfomycin Detoxifikation

beseitigt durch:

• Bacilliredoxin
• Bacillithiol-Disulfidbrücken-Reduktase

S-Mycothiolierung in Actinomyceten:

(Mrx1 = Mycoredoxin; reduziert S-mycothiolierte Proteine)

(Mtr = Mycothiol-Disulfid-Reduktase; reduziert MSSM (ist die ox. Form))

Funktionen:

• Entgiftung
• Co-Faktor für Aldehyd-DH
• Entgiftung von RON und Formaldehyd

beseitigt durch:

• Mycoredoxin
• Mycothiol-Disulfidbrücke-Reduktase

• = Thiol-basierter Sensor mit Zink-Redoxzentren

• Hsp33 wird durch ROS (H2O2 und HOCl) als redox-aktives Chaperon aktiviert

• Hsp33 hat 4 redox-sensitive Cysteine, die unter reduzierten Bedingungen Zn2+ binden

• die Oxidation von Hsp33 findet durch H2O2 statt; in Gegenwart von Hitze oder Oxidation von HOCl Dimerisierung und Aktivierung der Chaperonfunktion durch Exposition der Substratbindestelle (wobei Zn2+ freigesetzt wird)

• oxidiertes und aktives Hsp33 verhindert die Aggregation (= Zusammenlagern) von oxidativ geschädigten und falsch gefalteten Proteinen

der reduzierte Redoxzustand des Cytoplasmas wird durch das TrxAB und Grx/ GSH/ Gor-System und Thiol-Redoxpuffer (GSH, MSH, BSH) aufrechterhalten

Definition

• reaktive elektrophile Spezies; „e--liebend“; Redox-aktive Verbindungen mit elektronendefizienten Zentren

• Oxidation von Aminosäuren, Lipiden und Kohlenhydraten durch ROS führt zu „Reactive electrophile species (RES)“

Beispiele

• Methylglyoxal (MG) (= 2-Oxopropanol)

• Formaldehyde

• Diamide

Entstehung

• RES haben elektronendefiziente Zentren und führen zur irreversiblen Thiol-(S)-Alkylierung (Michael-Addukt-Bildung) von Cysteinen

Beseitigung durch Bakterien

• Chinon-Reduktasen und Thiol-abhängige Dioxygenasen

• Azoreduktasen

• Glyoxalase I und II

• Formaldehyd Reduktase (Fdh)

Trx/Grx-Systeme
(katalysieren Thiol bzw. Disulfid-Austauschreaktionen, um den reduzierten Zustand des Cytoplasmas beizubehalten)

Thiol-Redoxpuffer:

• Glutathion GHS

• Bacillithiol (BSH)

• Mycothiol (MSH)

• Superoxiddismutase (Sod)

• Katalase (Kat)

• Glutathion-Peroxidase (Gpx)

• Thiol-Peroxidas (Tpx)

• Peroxiredoxin (OhrA, Prx) bei Prokayoten und bei Eukaryoten

• Ruberythrine (Rbr) Reduktion von H2O2 (anaerobe Clostridien)

• Alkylhydroperoxid-Reduktase-System (AhpCF) Reduktion von H2O2

• Typ I (ABC-Transporter)

• Typ II (Typ 4 Pili)

• Typ III (VIRULENZFAKTOR)

• Typ IV (VIRUELNZFAKTOR)

• Typ V (Autotransporter)

• Typ VI (Chaperone)

Typ 1, 3 und 4 sekretieren in einer Etappe. Typ 2 und 5 sekretieren in 2 Etappen mittel Sec/Tat-pathways.

ABC-Transporter (Bsp. Hämolysin HlyA)

• HlyA interagiert mit dem ABC-Transporter-Komplex

• infolgedessen wird HlyA in Einzelschritten über beide Membranen während einer Reaktion translatiert, dabei wird ATP verbraucht

• es kommt zur Hydrolyse und zu einer Wechselwirkung von HlyD mit TolC

Typ IV Pilus

• der Pilus wird durch die Interaktion von Pseudopilinen und Exoproteinen im Cytoplasma verlängert

Typ III (VIRULENZ)

• ringartige Strukturen in bakterieller Membranen, dienen der Stabilisierung

• bilden längliche extrazelluläre Struktur (Nadel) aus

• kann in eukaryotische Membranen eindringen

• benötigt Energie aus ATP-Hydrolyse für die Translokation von bakteriellen Proteinen (T3SS Effektoren) in den Wirt

Typ IV (VIRULENZ)

• Pilus für den DNA-Transfer von Bakterienzelle in die Wirtszellen

• besteht aus VirB2 und ist befestigt mit VirB5, z.B. bei Agrobacterium tumefaciens

Autotransporter

• Autotransporter (= Polyprotein) wird über Sec ins Cytoplasma transportiert

• Leader-Sequenz spaltet mit SPase und lässt reifes Polyprotein ins Periplasm frei

• C-terminale β-barrel-Pore exportiert N-terminale Domäne, diese wird translatiert und autoproteolysiert

• es kommt zur Spaltung an der N-terminalen Domäne und zur Freilassung ins Medium

Definition

• OS = eine übermäßige Bildung von Radikalen Sauerstoffspezies (ROS) die zu temporären oder bleibenden Schäden führen kann

• alle aeroben Organismen haben Schutzmechanismen zur Reparatur von Schäden und zur Inaktivierung von ROS (und auch RES) entwickelt

• ROS können in Eukaryoten auch als second-messenger wirken

Entstehung

• wird durch exogene Ursachen verursacht:

• Tabletten (Medikamente),
• Rauchen, physischer und psychischer Stress,
• Ozon,
• ungesundes Essen,
• Umweltverschmutzungen etc.
   
• weiter exogene Ursachen (Bakterien):
• Photochemie
• Makrophagen
• Milchsäurebakterien
• oxic-anoxic interfaces
   
• Entstehung:

  • Durch stufenweise 1-Elektronenübertragung auf O2

  • Das hochreaktive Hydroxylradikal wird in der „Fenton“
    Reaktion gebildet

  • in der Atmungskette entstehen Superoxidanion und H2O2

  • Autooxidation von Flavoproteinen (Superoxidanion und H2O2)

Schäden in Zelle

• schädigen Kohlenhydrate

• Membranschäden

• Inaktivierung des Fe-S-Clusters

• irreversiblen DNA-Schäden

• Proteinschäden führen beispielsweise zu Cysteinmodifikationen

.

• durch Transpeptidierungs- Mechanismus verankert
   
• Protein hat C-terminale Sortiersignals mit einem konservierten LPXTG-Motiv.
   
• Sortase, ( Membranprotein ), spaltet Polypeptide zwischen Threonin und Glycin des LPXTG-Motives
• und katalysiert die Bildung einer Amidbindung zwischen der Carboxyl-Gruppe von Threonin und der Amino-Gruppe der Peptidoglycaneinheiten

Tat-abhängiger Transport:

• Proteine werden in gefaltetem Zustand transportiert
• zu exportierende Proteine besitzen ein Signalpeptid mit einem hochkonservierten Doppelarginin-Sequenzmotiv
• vom pH-Gradient der Cytoplasmamembran abhängige Exportweg
• unabhängig von ATP, ist abhängig vom pH-Gradient an der cytosolischen Membran und
• besitzt keine bekannten löslichen Komponenten, welche den Proteintransport vermitteln.

Allgemein besteht das System aus den Komponenten:

• TatA,TatB ,TatC, TatE
   
• wobei A,B und E membranassoziiert sind
• diese lagern sich also erst nach Erkennung des Signalpeptides zu einer aktiven Pore zusammen.
• gefaltete Proteine (meist mit Co-Faktor) werden über ein Signalpeptid an den Tat-Komplex gebunden und über die Membran transportiert
• TatA bildet die Pore; TatA kann verschieden groß sein und erlaubt somit den Transport von sehr verschieden großen Substraten
• TatB und TatC dienen der Erkennung
• nach dem Transport wird das Signalpeptid durch eine Signalpeptidase abgespalten

Sec-abhängiger Transport:

• meisten der aus dem Cytosol der Bakterienzelle zu transportierenden Proteine werden über einen Sec-abhängigen Proteinexportapparat transportiert.
• ATPabhängige Translokationsweg
• Proteine werden in einem entfalteten Zustand durch die Cytoplasmamembran translokiert.
• Neu synthetisierte Vorläuferproteine werden entweder schon während der Translation (cotranslational) oder kurz danach (posttranslational) durch sogenannte Targetingfaktoren gebunden
   
• Die Tranlokations- ATPase SecA vermittelt unter Verbrauch von ATP die Translokation dieser Peptide durch die Translokationspore, die von den membranintegrierten Proteinen SecY, SecE und SecG gebildet wird.
• Ein heterotrimerer Komplex, der aus SecD, SecF und YajC gebildet wird und mit der Translokationspore assoziiert ist, stimuliert die Proteintranslokation.
• Noch während oder kurz nach der Translokation erfolgt die Abspaltung des Signalpeptides durch Signalpeptidasen

(Im Gegensatz zu E. coli besitzt B. subtilis kein zu SecB homologes Protein. Es wurde mit CsaA ein neues Chaperon identifiziert, dem eine exportspezifische Aktivität zugeschrieben werden kann.)

• Transport von Lipoproteinen

Der Transport erfolgt über den Sec-anhängigen Transportweg von der inner membran zur outer membran, mit Hilfe des ABC-Transporter Lol-Systems.

Lipidmodifikation des Vorläuferlipoproteins nach dem Sec-anhänigen Transport.