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• Proteine werden in einer non-reducing SDS-Page in der ersten Dimension aufgetrennt

• die entstandenen Banden werden für die zweite Dimension horizontal auf ein reducing-SDS-Gel gelegen

• Proteine ohne Dsb werden als grade Linie sichtbar (A)

• Proteine die disulfid-verknüpft als Heterodimer (B-S-S-C) vorliegen werden unter der Diagonalen sichtbar (B+C)

• Proteine die disulfid-verknüpft als homodimer (E-S-S-E) vorliegen, werden als einzelne Proteine unter der Diagonale sichtbar (E)

• Proteine die intrazelluläre Dsb (D-SS oder F-SS) besitzen werden als sichtbare Proteinpunkte oberhalb der Diagonalen sichtbar (D+F)

• erst nach oxidativem Stress bilden sich Dsb aus

• Disulfidbrückenbildungen im Periplasma Proteine mit stabilen Disulfidbindungen in den oxidierten Bereichen

• bei E.coli: ist das Periplamsa der Bereich für die Disuldidbrückenbildung (Dsb)

• viele Proteine benötigen Disulfidbrücken für eine korrekte Faltung

• Disulfidbrückenbindungen sind in unterschiedliche Reaktionswege involviert:

1. Oxidation (DsbA und DsbB)

2. Isomerisation (DsbC, DsbD)

3. Reduktion von Sulfensäuren (DsbG, DsbD); neu beschrieben

4. Reduktion von Methioninsulfoxid (MsrAB-Trx; DsbD); neu beschrieben

= Cluster-basierter Sensor

• Aconitasen sind Fe-S Proteine, welche die Umwandlung von Citrat in Isocitrat innerhalb des TCA-Zyklus katalysieren

• können aber auch Sensoren für oxidativen Stress uns Eisenmangel sein

• unter Eisenmangel oder oxidativem Stress wird das [4Fe-4S] Cluster zerstört und das Enzym verliert seine katalytische Aktivität

• das resultierende Apo-Protein kann spezifisch an mRNAs binden und so als Post-Transkriptionaler Regulator fungieren; die mRNA-Bindestellen werden als „iron responsiv elements“ (ihres) bezeichnet

• ihres sind sogenannte Stem-Ioop-Strukturen, welche sich durch Rückfaltung palindromer Sequenzen bilden

• die Bindung von Aconitase kann die mRNA stabilisieren oder eine Translation verhindern

ArcBA (= Chinon-basierter Sensor für O2)

• Das ArcBA Zweikomponenten-Regulationssystem ist ein globaler Regulator der Genexpression unter mikroaeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen.

• In Abwesenheit von O2 wird ArcB an einem Histidin in der Transmitter-Domäne autophosphoryliert und überträgt den P-Rest über eine Kaskade auf den DNA-bindenden Response-Regulator ArcA

• ArcA~P reprimiert die Expression der terminalen Cytochrome o Oxidase, von TCA zyklus enzymen und Dehydrogenasen für das aerobe Wachstum (PDH) und aktiviert die Expression der O2-affineren terminalen Cytochrome d Oxidase

• ArcB detektiert nicht direkt O2, sondern den Redox-Status des Chinon-Pools der Atmungskette; Redox-Sensoren können also auch den Redox-Status des Chinon-Pools der Zelle messen, was zur Inaktivierung durch O2 führt (ArcB)

• die Aktivierung von ArcB erfolgt durch die Reduktion intermolekuarer Disulfidbrücken

FNR (= Regulator of fumarate-nitrate-respiration: Cluster-basierter Sensor)

• Das Fe-S Protein FNR von E. coli ist ein direkter Sensor von O2

• Unter anaeroben Verhältnissen bewirkt FNR die Expression alternativer Elektronenakzeptoren (anaerobe Respiration)

• FNR besteht aus 2 Domänen: einer N-terminalen sensorischen Domäne und einer C-terminalen DNA-Bindedomäne

• Unter anaeroben Bedingungen koordiniert die N-terminale Domäne ein [4Fe-4S] Cluster und bildet einen homodimeren Komplex

• Unter aeroben Bedingungen wird dieses Cluster zunächst in ein [2Fe-2S] Cluster und anschließend in das Apo-Protein überführt

• Dadurch wird FNR unter aeroben Bedingungen inaktiviert

S-Thiolierungen: Redoxpuffer werden oxidiert, um die Reduktion der Proteine aufrecht zu erhalten

S-Glutathionylierung in E. coli und Eukaryoten (gr-):

Funktionen:

• Co-Faktor für Glyoxalase
• Entgiftungsmittel
• Reduktion von Disulfidbrücken

beseitigt durch:

• Peroxidase und Reduktase
• Glutatredoxin
• Glutathion-Disulfid-Reduktase

S-Bacillithiolierung in Bacillus und Staphylococcus (gr+):

(Brx = Bacilliredoxin; reduziert S-Bacillithiolierte Proteine)

(Bdr = Bacillithiol-Disulfid-Reduktase; reduziert BSSB (ist die ox. Form))

Funktionen:

• entgiftet Antibiotika-Toxine
• bildet Co-Faktor zur Entgiftung von ROS/ RES (Proteinschutz)
• Fosfomycin Detoxifikation

beseitigt durch:

• Bacilliredoxin
• Bacillithiol-Disulfidbrücken-Reduktase

S-Mycothiolierung in Actinomyceten:

(Mrx1 = Mycoredoxin; reduziert S-mycothiolierte Proteine)

(Mtr = Mycothiol-Disulfid-Reduktase; reduziert MSSM (ist die ox. Form))

Funktionen:

• Entgiftung
• Co-Faktor für Aldehyd-DH
• Entgiftung von RON und Formaldehyd

beseitigt durch:

• Mycoredoxin
• Mycothiol-Disulfidbrücke-Reduktase

• = Thiol-basierter Sensor mit Zink-Redoxzentren

• Hsp33 wird durch ROS (H2O2 und HOCl) als redox-aktives Chaperon aktiviert

• Hsp33 hat 4 redox-sensitive Cysteine, die unter reduzierten Bedingungen Zn2+ binden

• die Oxidation von Hsp33 findet durch H2O2 statt; in Gegenwart von Hitze oder Oxidation von HOCl Dimerisierung und Aktivierung der Chaperonfunktion durch Exposition der Substratbindestelle (wobei Zn2+ freigesetzt wird)

• oxidiertes und aktives Hsp33 verhindert die Aggregation (= Zusammenlagern) von oxidativ geschädigten und falsch gefalteten Proteinen

der reduzierte Redoxzustand des Cytoplasmas wird durch das TrxAB und Grx/ GSH/ Gor-System und Thiol-Redoxpuffer (GSH, MSH, BSH) aufrechterhalten

Definition

• reaktive elektrophile Spezies; „e--liebend“; Redox-aktive Verbindungen mit elektronendefizienten Zentren

• Oxidation von Aminosäuren, Lipiden und Kohlenhydraten durch ROS führt zu „Reactive electrophile species (RES)“

Beispiele

• Methylglyoxal (MG) (= 2-Oxopropanol)

• Formaldehyde

• Diamide

Entstehung

• RES haben elektronendefiziente Zentren und führen zur irreversiblen Thiol-(S)-Alkylierung (Michael-Addukt-Bildung) von Cysteinen

Beseitigung durch Bakterien

• Chinon-Reduktasen und Thiol-abhängige Dioxygenasen

• Azoreduktasen

• Glyoxalase I und II

• Formaldehyd Reduktase (Fdh)