DNA-Sequenzierung nach Sanger

Gentechnik

Gentechnik

8

0.0 (0)

J. H.

Study

J. H.

About these flashcards

Diese Lernkarten bieten einen Überblick über die DNA-Sequenzierung nach Sanger, die auf universitärem Niveau angesiedelt ist. Sie konzentrieren sich auf das Prinzip der Methode, die Verwendung von Nukleotiden und Polymerasen sowie die Bedeutung von Primern und Kettenabbrüchen. Die Karteikarten erklären auch die praktische Anwendung, einschließlich der Erzeugung von Fragmenten und der Detektion durch Kapillarelektrophorese. Besonders nützlich sind sie für Studierende und Forscher, die sich mit molekularbiologischen Techniken befassen und die Genauigkeit sowie die Qualität der Sequenzierung verstehen müssen.

Flashcards

8

Students

0

Language

German

Category

Biology

Level

University

Created / Updated

14.07.2025 / 15.07.2025

Was ist das Ziel der DNA-Sequenzierung?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

Die genaue Reihenfolge der Nukleotide in einem DNA-Abschnitt in Erfahrung zu bringen

Welche zwei grundlegenden Methoden gibt es?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

• chemische Methode nach Maxam/Gilbert • enzymatische Methode (Kettenabbruchverfahren) nach Sanger

Wofür sind die Dideoxynucleotide triphosphate im Kettenabbruchverfahren?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

Bei der DNA-Synthese entscheidet sich an der Nukleotid-Bindestelle ob die Synthese statt findet oder nicht falls H dranhängt > Kettenabbruch > Diedeoxynucleotide induzieren Kettenabbrüche > verschieden lange DNA Segmente

Was ist das Prinzip der DNA-Synthese nach Sanger?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

Es werden 10x mehr Desoxy Nukleotide verwendet als normale > PCR erzeugt verschieden lange DNA Segmente > zufälliger Prozess > Größe wird durch Gel-Elektrophorese getrennt > dNTP's sind fluoreszenzmarkeirt > detektiert welche Base an welcher Stelle ist

Wie sieht die DNA Sequenzierung nach Sanger in der Praxis aus?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

• vier unterschiedliche fluoreszenzmarkierte ddNTP's • cycle sequencing mit hitzestabiler DNA-Polymerase zur erzeugung einzelsträngiger DNA zur linearen Vervieffältigung (nur ein Primer) • Kapillargelelektrophorese im Gerät mit 1 bis 96 Kapillaren • Nachweis der Fragmente über Laser und FLuoreszenzdetektor • Minimale DNA-Menge: 20 ng (8fmol) Plasmid-DNA > 10^8 Moleküle • Max. 800 bp können in einem Lauf sequenziert werden

Welche Merkmale des Cycle Sequecing zur Erzeugung der Fragmente gibt es?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

• Eintopf-Prinzip: Primer Template Polymerase unmarkierte dNTP's + 4 markierte ddNTP's in ein Reaktionsgefäß • nur ein Primer (ca. 25 Cyclen) > wählt richtigen Abschnitt • verbesserte Resultate durch Enzym-mischung aus Taq-Polymerase + Pwo-Polymerase mit Proofreading-Aktivität • Matrize > Plasmidvektoren > stabil

Wie viele Nukleotide können durch Kapillarelektrophoserese detektiert werden?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

• pro Kapillare 800 bp in einem Lauf (2h) • in 4 Kapilalren > 800 bp * 4 Proben = 3200 Nukleotide

Was sind die Quality Values der Detektierung?

Keyboard commands:

= turn,

= for-/backward,

= scroll

• 10: 10% Wahrscheinlichkeit das die Base inkorrekt ist • 20: 1% • 30: 0.1 % • 40: 0.01% • 50: 0.001% > Größe und Farbe der Quality Value bars entsprechen den Quality Values 50 bis 99

1 / 8

Flashcards

Was ist das Ziel der DNA-Sequenzierung?

Die genaue Reihenfolge der Nukleotide in einem DNA-Abschnitt in Erfahrung zu bringen

Welche zwei grundlegenden Methoden gibt es?

• chemische Methode nach Maxam/Gilbert • enzymatische Methode (Kettenabbruchverfahren) nach Sanger

Wofür sind die Dideoxynucleotide triphosphate im Kettenabbruchverfahren?

Bei der DNA-Synthese entscheidet sich an der Nukleotid-Bindestelle ob die Synthese statt findet oder nicht falls H dranhängt > Kettenabbruch > Diedeoxynucleotide induzieren Kettenabbrüche > verschieden lange DNA Segmente

Was ist das Prinzip der DNA-Synthese nach Sanger?

Es werden 10x mehr Desoxy Nukleotide verwendet als normale > PCR erzeugt verschieden lange DNA Segmente > zufälliger Prozess > Größe wird durch Gel-Elektrophorese getrennt > dNTP's sind fluoreszenzmarkeirt > detektiert welche Base an welcher Stelle ist

Wie sieht die DNA Sequenzierung nach Sanger in der Praxis aus?

• vier unterschiedliche fluoreszenzmarkierte ddNTP's • cycle sequencing mit hitzestabiler DNA-Polymerase zur erzeugung einzelsträngiger DNA zur linearen Vervieffältigung (nur ein Primer) • Kapillargelelektrophorese im Gerät mit 1 bis 96 Kapillaren • Nachweis der Fragmente über Laser und FLuoreszenzdetektor • Minimale DNA-Menge: 20 ng (8fmol) Plasmid-DNA > 10^8 Moleküle • Max. 800 bp können in einem Lauf sequenziert werden

Welche Merkmale des Cycle Sequecing zur Erzeugung der Fragmente gibt es?

• Eintopf-Prinzip: Primer Template Polymerase unmarkierte dNTP's + 4 markierte ddNTP's in ein Reaktionsgefäß • nur ein Primer (ca. 25 Cyclen) > wählt richtigen Abschnitt • verbesserte Resultate durch Enzym-mischung aus Taq-Polymerase + Pwo-Polymerase mit Proofreading-Aktivität • Matrize > Plasmidvektoren > stabil

Wie viele Nukleotide können durch Kapillarelektrophoserese detektiert werden?

• pro Kapillare 800 bp in einem Lauf (2h) • in 4 Kapilalren > 800 bp * 4 Proben = 3200 Nukleotide

Was sind die Quality Values der Detektierung?

• 10: 10% Wahrscheinlichkeit das die Base inkorrekt ist • 20: 1% • 30: 0.1 % • 40: 0.01% • 50: 0.001% > Größe und Farbe der Quality Value bars entsprechen den Quality Values 50 bis 99

Study