DNA-Sequenzierung nach Sanger

• chemische Methode nach Maxam/Gilbert • enzymatische Methode (Kettenabbruchverfahren) nach Sanger

Bei der DNA-Synthese entscheidet sich an der Nukleotid-Bindestelle ob die Synthese statt findet oder nicht falls H dranhängt > Kettenabbruch > Diedeoxynucleotide induzieren Kettenabbrüche > verschieden lange DNA Segmente

Es werden 10x mehr Desoxy Nukleotide verwendet als normale > PCR erzeugt verschieden lange DNA Segmente > zufälliger Prozess > Größe wird durch Gel-Elektrophorese getrennt > dNTP's sind fluoreszenzmarkeirt > detektiert welche Base an welcher Stelle ist

• vier unterschiedliche fluoreszenzmarkierte ddNTP's • cycle sequencing mit hitzestabiler DNA-Polymerase zur erzeugung einzelsträngiger DNA zur linearen Vervieffältigung (nur ein Primer) • Kapillargelelektrophorese im Gerät mit 1 bis 96 Kapillaren • Nachweis der Fragmente über Laser und FLuoreszenzdetektor • Minimale DNA-Menge: 20 ng (8fmol) Plasmid-DNA > 10^8 Moleküle • Max. 800 bp können in einem Lauf sequenziert werden

• Eintopf-Prinzip: Primer Template Polymerase unmarkierte dNTP's + 4 markierte ddNTP's in ein Reaktionsgefäß • nur ein Primer (ca. 25 Cyclen) > wählt richtigen Abschnitt • verbesserte Resultate durch Enzym-mischung aus Taq-Polymerase + Pwo-Polymerase mit Proofreading-Aktivität • Matrize > Plasmidvektoren > stabil

• pro Kapillare 800 bp in einem Lauf (2h) • in 4 Kapilalren > 800 bp * 4 Proben = 3200 Nukleotide

• 10: 10% Wahrscheinlichkeit das die Base inkorrekt ist • 20: 1% • 30: 0.1 % • 40: 0.01% • 50: 0.001% > Größe und Farbe der Quality Value bars entsprechen den Quality Values 50 bis 99