Molbio der Pflanzen

1. ER synthetisiert Proteine, die in den sekretorischen Weg eintreten, verarbeitet und sortiert sie auch, fügt Proteine Glykane hinzu und synthetisiert verschiedene Lipidmoleküle
2. Golgi-Apparat besteht aus dem Komplement der Golgi-Stapel und dem Trans-Golgi-Netzwerk. Es erhält neu synthetisierte Lipide und Proteine aus dem ER. Es ist auch eine Kohlenhydratfabrik, denn: Sie baut komplexe (verzweigte) Polysaccharide der Zellwand wie Pektine und Xyloglucane zusammen. Sie synthetisiert die Oligosaccharid-Seitenketten der Glykoproteine im sekretorischen Weg.  Sie produziert Glykolipide für Plasmamembran und Tonoplasten (= Membran, das das pflanzliche Vakuole umgibt).
3. TGN fungiert als ein Zentrum im Informationsfluss zur und von der Plasmamembran.

1. Budding: Ein Vesikel knospt von einer Spendermembran.
2. Delivery: Das Vesikel wird an eine Zielmembran abgegeben.
3. Tethering: Das Vesikel ist an einen Akzeptor oder eine Zielmembran mittels eines Anbindemoleküls oder -komplexes gebunden.
4. Docking: Das angebundene Vesikel wird fest angedockt, wenn der V- und t-SNAREs-Reißverschluss einen SNARE-Pin bildet. Dies wird als trans-SNARE-Komplex bezeichnet, da sich die SNAREs auf verschiedenen Membranen befinden.
5. Fusion: Die Vesikel- und Zielmembranen verschmelzen, wodurch der Vesikelinhalt (cargo) an das Zielkompartiment abgegeben wird. Der SNARE-Komplex wird jetzt als cis-SNARE-Komplex bezeichnet, da die Vesikelmembran nun an die Zielmembran angrenzt.
6. Recycling: Die t- und v-SNAREs werden jetzt recycelt. Dies bedeutet, dass der enge Komplex aufgebrochen werden muss, und dies geschieht aufgrund des NSF-ATPase/SNAP-Komplexes, wobei NSF für NEM-sensitives Fusionsprotein steht und eine AAA-ATPase ist.

1. Spezifitaet:

• Cargo-Selektion mittels ARF GTPasen bei "Budding"
• Anbinden der Vesikeln an Zielmembran mittels Rab GTPase und Anbindemolekuele (Tethering factors) bei "Tethering"
• Theorie der "cognate" SNAREs => ein gegebenes v-SNARE kann nur mit einer bestimmten Menge von t-SNAREs einen Komplex bilden bei "Fusion"

2. Geschwindigkeit:

Die Geschwindigkeit bei Membrane Traffic wird erreicht, indem der Prozess der Vesikelfusion bis zur Andockphase eingestellt wird und dann das Fusionsereignis zur richtigen Zeit am richtigen Ort durch Entfernen von CLAMP ausgelöst wird.

• Synaptotagmin (CLAMP; Repressor der Membranfusion) wird durch Calcium (Trigger) inaktiviert, wodurch die Membranfusion stattfinden kann.

SNAREs sind Coiled-Coil-Membranproteine mit einem hochkonservierten SNARE-Motiv aus 60 Aminosäuren neben dem Membrananker. Sie vermitteln in der Zelle die Fusion von Vesikeln untereinander oder mit der Zellmembran.

SNAREs are noetig und ausreichend um die Membranfusion zu ermoeglichen. Es wurde beispielsweise festgestellt, dass tierische Zellen, die die interagierenden Domänen von v- und t-SNAREs auf der Zelloberfläche exprimieren, spontan fusionieren.

Sec1-Proteine werden für die Bildung von SNARE--pin und die Membranfusion benötigt. Wenn sich SNARE-Moleküle paaren, bilden sie ein Vier-Helix-Bündel, wobei eine Helix von einem v-SNARE, eine von einem t-SNARE und zwei zusätzliche Helices von einem als SNAP25 bezeichneten Protein bereitgestellt wird.

Aktuelle Modelle postulieren, dass die freigesetzte freie Energie verwendet wird, um Doppelschichten zu verschmelzen, wenn sich ungefaltete SNARE-Proteine zu einem Vier-Helix-Bündel falten. Mit anderen Worten, die Proteinfaltung ist thermodynamisch an die Membranfusion gekoppelt.

• Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Formation der beschichteten Vesikeln (mit den Huellproteinen).
• Sie sind kleine GTP-bindende Proteine (aktive Form: GTP gebunden und inaktiv: GDP gebunden). Aktive Formen rekrutieren Huellproteine und fangen Cargo ein.
• ARF GTPasen spielen eine wichtige Rolle bei der Sortierung, Vesikelformation.
• Cargo-Erkennung geschieht durch Rezeptoren und die Formation der Vesikeln sowie Membrankruemmung geschieht durch die Huellproteine

ARF-GDP wird zur ARF-GTP gewandelt (durch die ARF-GEFs).

GEF: Der Austausch von GDP gegen Triphosphatnukleotid wird durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) vermittelt.

GAP: Umgekehrt wird die Hydrolyse von gebundenem GTP durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) vermittelt.

• Zielmembran besitzt Anbindefaktoren wie lange coiled-coil Proteine oder grosse Mehruntereinheitkomplexe.
• Vesikel besitzt Rab GTPasen => binden Anbindefaktoren an Zielmembran, wenn sie GTP gebunden sind (also aktiv);

• GNOM befindet sich auf Recycling-Endosomen
• GNOM codiert fuer ARF-GEF

1. Zuerst wird das Ubiquitin durch E1 (Ubiquitin aktivierendes Enzym) aktiviert. Dafuer wird ATP gebraucht.
2.  Ubiquitin wird dann von E1 zur E2 transferiert (E2: Ubiquitin konjugierendes Enzym).
3.  Es wird eine Isopeptid-Bindung mithilfe von E3 (Ubiquitin Proteinligase) zwischen Zielprotein und Ubiquitin hergestellt.

Subtratspezifitaet: Substratprotein (Zielprotein) wirdd durch E3 erkannt.

• 26S Proteasome: 2 19S Lid & 1 20S Core
• Obere 19S Lid erkennt ubiquitinierte Proteine und transportiert diese zum Core.
• 20S Core deubiquitiniert, entfaltet und degradiert die Proteine.
• Untere 19S Lid gibt die degradierte Proteinstuecke frei.

• HY5 ist ein Transkriptionsfaktor, der sich immer im Nukleus befindet.
• COP1 aendert seine Lokation abhaenging von der Licht. Er ist im Nukleus bei Dunkel und im Cytoplasma bei Licht.
• COP1 hat ein RING-Finger-Domaene, der an E2 bindet, ein NIS (Nuklear-Inport-Sequenz) und NES (Nuklear Export Sequenz), sowie WD40 repeats, die fuer die Interaktiven mit Subtrate und Photorezeptoren sorgen. 
• Gene, die von COP1 unterreguliert werden, werden normalerweise hochreguliert durch HY5.

COP1 ubiquitiniert HY5, damit es degradiert wird und seine Funktion nicht ausuebt. Im Dunkel deaktiviert und degradiert COP1 die HY5 im Nukleus, so dass die korrekte Dunkelverhalten ausgeuebt wird. (COP1 degradiert auch Photorezeptoren bei Dunkelheit). Bei Licht wird COP1 zur Cytoplasma transportiert, so dass es nicht HY5 deaktiviert und HY5 exprimiert werden kann. COP1 wird durch aktive Photorezeptoren und Kinasen im Cytoplasma inaktiviert.

Auxin wird fuer:

• Apical Dominance  => so dass die Zelle nach oben waechst (nicht branches bekommt)
• Phototropism (Bewegen in Richtung des Lichts)
• Gravitropism
• Wurzelmorphogenesis

benoetigt.

Auxin bindet an TIR1 (ein E3 Ligase) und formiert ein Komplex fuer die Bindung an AUX/IAA Repressor (wird degradiert). Damit wird ARF (Transkriptionsfaktor: Auxin Response Faktor) aktiviert (wenn AUX/IAA Repressor aktiv ist wird ARF inaktiv). Dann findet Genexpression fuer Auxinantwort statt.

MONOPTEROS ist ein ARF5 Transkriptionsfakor (verantwortlich fuer die Wurzelmorphogenesis). "bodenlos" (gain of function mutation) ist ein Repressor fuer die ARF5. Bei "monopteros" (loss of function mutation) wird ARF5 deaktiviert.

Bei Licht wird IAA durch HY5 aktiviert und exprimiert. Damit wird ARF inaktiviert/repremiert. Deswegen findet keine Auxin-Antwort statt. Damit bleibt das Hypocotyl klein. Bei Dunkelheit wird HY5 durch COP1 degradiert, deswegen wird auch kein IAA gebildet und ARF exprimiert. Dann findet Auxinantwort statt und das Hypocotyl wird laenger.

Epistasis: 2 verschiedene Gene wirken auf dem gleichen Weg (Pathway)

• Wenn der Phaenotyp der Doppelmutante ab ist der Gleiche wie bei der Einzelmutante a, dann ist a epistatisch ueber b.

Synergie: 2 verschiedene Gene wirken zusammen in einem Prozess (z.B. als ein Proteinkomplex oder funktionell redundante Proteine)

• Doppelmutante ab ist ein lethaler Phaenotyp (keine additive Wirkung bei Einzelmutanten).
• keule und knolle Mutanten haben jeweils noch Zellwaende. Der Doppelmutant keule/knolle hat keine Zellwaende mehr und stirbt.

Suppression:

• Doppelmutante sieht wie Wildtyp aus, da mutierte a und b interagieren zusammen.
• Einzelmutante: a und B interagieren nicht zusammen => Mutantphaenotyp

A und B sind unabhaenging voneinander:

• wenn ein additiver Phaenotyp vorleigt.

WT: Wildtyp

X\(\Delta\): ORF-Deletion der X-Gen

Y\(\Delta\): ORF-Deletion der Y-Gen

3 moegliche Phaenotypen der Doppelmutanten:

• schwarz: Additiver Phaenotyp (X und Y ist unabhaengig)
• blau: Synergie: X und Y wirken zusammen in einem Prozess => Doppelmutante ist deutlich weniger fit.
• gelb: Epistasis; X und Y wirken der Reihe nach in einem Pathway => Y ist epistatisch ueber X.

Genetische oder funktionelle Interaktionen:

• Doppelmutantenanalyse
• Computational Methoden

Protein-Protein-Interaktionen:

• Biochemische Methoden
• Transfer von Hitze und Fluoreszenz
• Doppelmutantenanalyse
• Computational Methoden
• Yeast two hybrid

• Stammzellen teilen sich assymetrisch in eine Stammzelle und eine somatische Zelle.
• Eine Teilung ist assymetisch, wenn die Tochterzellen unterschiedliche Schicksal (1 oder 0) haben.
• Assymetrische Zellteilung ist charakterisiert durch die Entwicklung der Polaritaet und der ungleiche Distribution der Zellkomponente.

• Abfallreduzierung
• Effiziente Gestaltung von Duengung
• Reduzierung von Verbrauch der tierischen Produkten

• Abfallreduzierung
• Vebrauch von nicht-tierischen Produkten (Consumer choice)
• Recycling
• Effiziente Nutzung der Ressourcen
• Technologie und Genetic Engineering (Gentechnik)

1. Beispiel: Umwandlung eines Plfanzenlipids (Ricinolsaeure) zu Nylon

2. Beispiel: Pflanzen basierte Impfstoffe, zum Beispiel Reis-mukosale Impfstoffe

Vorteile: Pflanzen basierte Impfstoffe sind kosten-effizient, gut fuer die Umwelt, sicher und zeit-effizient. Sie sind ueber laengere Zeit stabil und brauchen keine Kaltlagerung.

Probleme: Verduennung durch Mukosale Sekretionen. Werden von Proteasen und Nukleasen angegriffen. Werden von epithelialen Barrieren ausgeschlossen.

• Kleinstes Genom unter den hoeheren Plfanzenarten
• Kurzer Lebenszyklus
• Selbst-Bestaeubung
• Kann ausgekreuzt und transformiert werden
• Lebensstrategie: Geschwindigkeit (setzt Samen bevor es verdraengt wird)

1. Die systematische, integrative Untersuchung komplexer Wechselwirkungen in biologischen Systemen.  Das Ziel ist es, ein Modell der Pflanze als Ganzes zu erstellen, das Prozesse über alle Ebenen der biologischen Organisation (molekular, zellulär, physiologisch, organismisch und ökologisch) beschreibt.
2. Beschreibung biologischer Systeme, durch quantitative Messung mehrerer Komponenten gleichzeitig und durch rigorose Datenintegration mit mathematischen Modellen. Es ist ein iterativer Prozess, wobei die Theorie nach jedem Zyklus verfeinert wird (siehe Bild).

Vorwärtsgenetik ist ein molekulargenetischer Ansatz zur Bestimmung der genetischen Basis, die für einen Phänotyp verantwortlich ist. Vorwärtsgenetische Methoden beginnen mit der Identifizierung eines Phänotyps und finden oder erstellen Modellorganismen, die das untersuchte Merkmal aufweisen.

Dabei kann eine Mutantenanalyse durchgefuehrt werden, z.B. durch EMS (chemische Mutagenese), durch die man jedes Gen, welches Mutationgenetyp vorweist, bestimmen kann.

• Forward Genetics geht vom Phaenotyp zum Genotyp
• Reverse Genetics: Man kennt den Genotyp kann ihm aber keinen Phaenotyp zuordnen.

HY5: ist benoetigt fuer das korrekte Lichtverhalten (photomorphogenesis), also die Entwicklung von offenen Catalydons und der Unterdrueckung von Entwicklung des Hypocotyls im Embryo.

COP1: wird fuer das korrekte Dunkelheitsverhalten benoetigt, also unterdrueckt es die lichtabhaengige Entwicklung der Pflanze => negativ Regulator der Photomorphogenesis

COP1 inaktiviert und degradiert HY5 bei Dunkelheit (im Nukleus). Bei Licht wird COP1 zur Cytoplasma transportiert, so dass HY5 exprimiert werden kann. In Cytoplasma wird COP1 durch Photorezeptoren und Kinasen inaktiviert.

Lichtverhalten von Arabidopsis-Samen:

• offene Cotyledons
• kurze Hypocotyl
• lange Wurzeln

bei mutante hy5: geschlossene Cotyledons, lange Hypocotyl, kleine Wurzeln

Dunkelverhalten von Arabidopsis-Samen:

• geschlossene Cotyledons
• lange Hypocotyl
• kurze Wurzeln

bei mutante cop1: offene Cotyledons, kurze Hypocotyl, lange Wurzeln

Es ist fuer die Entwicklung der Wurzel zustaendig.

GNOM: Fuehrt zu assymetrischer Zelldivision -> Unterteilung in basale Zelle (spaeter Nabelschnur) und apikale Zelle (spaeter Embryo).

Bei gnom (Mutante) ist die erste Zelldivision symmetrisch, das fuehrt zu fehlender Zellpolaritaet. Die Pflanze verliert alles und sieht im extremen Fall wie ein Ball aus.

ESTs sind kurze DNA-Sequenzen von meist 100–800 Basenpaaren Länge, die durch die teilweise Sequenzierung von cDNAs von deren 5'- oder 3'-Ende ausgehend gewonnen werden. Da cDNAs durch die reverse Transkription von mRNA erzeugt werden, stellen ESTs also einen Ausschnitt der Sequenz von Genen dar, die im betrachteten Lebewesen, Gewebe oder Zelltyp exprimiert werden, also aktiv sind. ESTs sind dabei im Vergleich zu Komplett-cDNA-Sequenzen oder Genomsequenzierungen mit relativ geringem Aufwand erzeugbar. Die gewonnenen Sequenzinformationen können anschließend in eine EST-Datenbank eingespeist werden und mittels Sequenzvergleichen und bioinformatischer Methoden als Grundlage weiterer Analysen dienen.

Genkarte:= die lineare Anordnung der Gene im Genom

• Auf einer genetischen Karte ist die relative Reihenfolge von Genorten eingetragen, die ueber die Kopplung zweier Gene und Rekombinationsfrequenzen bestimmt werden (Einheit: cM: 1 cM bedeutet eine Rekombinationshaeufigkeit von 1% => je weniger haeufig sich die Gene rekombinieren, desto naeher liegen die untersuchten Genorte beieinander. Bei einem Abstand von 50 cM gelten die Gene als ungekoppelt, d.h. man kann mittels Kopplungsanalysen nicht mehr feststellen, ob 2 Gene auf einem Chromosom liegen oder nicht. Die Gene gelten als gekoppelt, wenn (RF)<50%/50 cM).
• Auf einer physikalischen Genkarte sind die genauen Abstaende zw. Genen gemessen in Basenpaaren eingetragen.

=> wie oft die Gene rekombiniert werden (je mehr Rekombination desto mehr liegen die Gene weit auseinander)

RF = Anzahl der rekombinanten Individueen/Anzahl der Gameten