Proteine

• phi, psi Winkel sind vereinbar mit den meisten AS
• H-Brücke zw C=O von ASi mit N-H von ASi+4 (Nahordnung)
• 5,4 Å pro Windung
• in Proteinen leicht abweichende Geometrie, statistische präferenz für einzelne AS
• Ala hat stärkste Tendez zur Bildung der Helix
• An cß verzwigte AS weniger günstig
• Pro führt zur störung der Geometrie (Helixbrecher)
• N/C Cap: Asn und Gln sättigen über ihre SK die offenen H BB DOnoren und Akzeptoren
• elektrostatische Besonderheit: Parallele Ausrichtung der Peptidgruppen.> Makrodipolmoment 0,5-0,7. Elementarladungen an der Enden

Serum Albumin

• Basiseinheit ß Strang
• Anordnung parallel oder antiparallel (stabiler) mit H BB Netzwerk dazwischen
• natürliche ßFB sind verdrillt
• Fernordnung: in der 1ärstruktur entfernte AS werden räumlich zusammengestellt - Rolle der Turns

Immunglobulin, ß-Keratin

mit N (native), U (unfolded), f(u) (fraction unfolded)

Zusammenhang mir freien Enthalpie: Vant Hoffsche Gleichung

Sigmoidalen Kurvenverlauf

Parameter m (Kooperativitätsparameter)

Gleichung der Observablen

änderung der Konformation der Struktur des Moleküñs unter dem Einfluss sich anlagernden niedermolekularen Verbindungen.

Amidbindung zw seintenständige e-Aminogruppe von L-Lysin und seitenstäntige Carboxygruppe von L-Asparaginsäure.

die Verknüpfung der AS erfogt also nicht über a-ständige Amino und Carboxylgruppen.

Energieunterschied des Wechsels von einem Medium in das andere zB von purem Wasser in Lösung des Ko Solvens in Wasser der Proteins

De und Renaturierungsstudien, Rückfaltung von Rekombinanten Proteinen aud einschlussekörpern

Wirkmechanismen: AUfbrechen von H-Brücken, Erhöhung der Löslichkeit  hydrophober Reste

Reaktion verhindern durch: 

• Ernierdrigung des pH, sodass Lys zunehmend Protoniert und damit weniger reaktiv vorliegt (nicht mehr als Nukleophil)
• Ammonium zum Puffer geben, damit sich das GGW auf Seiten des Harnstoffs verschiebt

alternatives Reagenz, stabiler: Gusnidiniumchlorid

Harnstoff kann sich zu cyanat und ammonium zersetzen (8M benötigt)

Guanidiniumchlorid hat die stärkere Wirkung (6M reichen) 

• besitzt keine Disulfidbindungen
• Synthese im reduzierenden Cytoplasma
• kein sekretorisches Enzym
• zwei natürliche freie Thiolreste: Cys 97, Cys54

Substitution Ile3 durch Cys

Mutante zeigt erhöhte thermische Stabilität, ist eine Folge der kovalenten Quervernetzung innerhalb der polypeptidkette.

Oxidierte Form immer stabler als reduzierte Form

Die beiden effektivsten Disulfidbindungen 9-164 und 12-142 umspannen jeeils einen großen Bereich der Polypeptidkette (Schleifenumfang), und sie fixieren eine flexible Region in der 3ärstruktur.

Nachtrag: Flexibilität in der Proteinlösung

• Geometrisches Problem: Abstand zw 21 und 142 eig. zu groß, allerding Flexibilität besteht.

Versuch zur Verbesserung der AS-Packung im T4 Lysozym zwecks Verständnis der Rolle der "hydrophoben Kerns" und evtl. erhöhung der (Thermo)stabilität des Proteins

• Fokusierung auf hydrophoben Effekt: Packung unpolarer SK im Proteininneren
• Abschätzung aus den Freien Transferenergien der hydrophoben AS: ≈ 24 cal/ mol*Å^2 -> AS-Substitutionen, die diesen Betrag erhöhen, sollten daher die Proteinstabilität verbessern, sofern sie keine sterische Spannung erzeugen. (Begrabene OberflÄche hoch, Stabilität hoch)
• Prüfung der Kavität:

1. Eine kleinere SK soll sich durch eine größere ersetzen lassen
2. Die neu eingefügte SK sllte keine Kontakte <3,2Å mit ihrer Umgebung eingehen
3. Die SK-Diederwinkel sollten denen in hoch aufgelöste Proteinstrukturen entsprechen
4. Des auszutauschende Rest sollte eine Solvesexponierte Oberfläche = 0 besitzen

Die Packungsdichte innerhalb eines Proteins kann ehöht werdenan viele stellen im Bereich der ausgetauschten AS treten sterische Spannungen auf aufgrund leichter Überlappung von VdW Radien mit benachbarte Reste

Die Summe aus der ungünstigen Stereochemie resultierende Spannungsenergien (VdW und DIederspannung) überwiegt ggü der hydrophoben Stabilisierung 

Der sehr beschränkte Satz der durch den genetischen Code erlaubten hydrophoben SK gestattet nur begrenzte Optimierung der AS-Packung in Proteinen.

1. Katalytische Triade: Ser221, His64, Asp32
2. Klasse der Hydrolasen, Subklasse der Endoproteasen, Familie der Serin Proteasen. Enzymatischer Mechanismus: katalytische Hydrolyse der Peptidbindung, typisch für Serinproteasen: Katalystische Triade nahezu identische Anordnung mit Trypsin bei unterschiedlicher Faltung. -> Bsp für kovergente Evolution
3. Produktion der rekombinanten Varianten in transformierten und enzymdefizienten B.subtilis Zellen in ggw eines B subtilis WT Stamms zwecks Maturierung des Präproezyms. Trick: Reinigung aus dem Kulturüberstand und Abtrennung vom WT Enzym mittels Thiol-Separose anhand der zusätzlich eingeführten Mutation S24C-> Oberflächenexponierter cys Rest
4. Bild
5. Im Gegensatz zu REsten, die an der Substratbindung beteiligt sind, wird v.a. die Wechselzahl dramatisch erniedrigt , wohigegen die Michaelis Konstante nur wenig beeinflusst wird. Weitere Reaktionsbeschleunigung um Faktor 1000 durch Reste, die den übergangszustand stabilisieren. Bei S221A kann kein Acylenzym-Intermediat gebildet werden, sodass H2O direkt als Nukleophil wirkt. Die reste de Triade agieren stark synergistisch und beschleunigen nur zusammen die Substrat-Hydrolyse

Met: Flexibler, aber reaktiver

Leu: nicht so reaktiv, aber schwierige statik durch hydrophobe WW

Methionin ist instabiler wegen unverzweigter Struktur; Flexibilität der SK liefert einen entropisch ungünstiegen Beitrag zur Proteinfaltung. S ist reaktiver als die Methylgruppe des Leucins.

1. Kavität,  Unterschied Freien Transferenrgien
2. Kavität: a) ∆∆G = -1,9 kcal/mol * Å²  *∆V (Volumen) b) ∆∆G = -1,9 kcal/mol * Å² *∆S (Oberfläche)
3. Verkleinert man die Kavität, ohne dabei die Freiein Transferenergien der AS negativ zu beeinflussen oder ungünstige sterische WW auszulösen, dann sollte dies die Proteinstabilität verbessern.
4. Hydrophobie: mit ∆G = -RTlnK des Verteilungskoeffizienten zB Wasser-> Octanol. Stark von Bedingungen abhängig

1. 

• Positiv:
  • Erhöhung der thermischen Stabilität durch kovalente Qervernetzung innerhalb der Polypeptidkette bei der oxidierten Form der Mutante
  • Kontrolle der Enzymaktivität über das Redoxpotential, wenn eine Disulfidbrücke eingeführt wird, die die Furche des aktive zentrum überbrückt und somit den Zugang für das Substrat sterisch hindert.
• Negativ:
  • Die reduzierte Form der Mutante ist weniger stabil als der WT, da die Einführung der Cys-Reste andere wichtige WW unterbricht.
  • Sterische Hinderung des akt Zentrums
  • fixierung flexiber Regionen in der 3ärstruktur

2. ?

3. Entropische destabilisierung des entfalteten Zustands; Erniedrigung von ∆Sconf der random coil durch kovalente Quervernetzung. bild

4. 

• Es gibt Kavitäten, die mit größeren Resten gefüllt werden können. Die Packungsdichte eines Moleküls kann also erhöht werden-> satibilierend (Die Füllung der Kavität kann aber auch leich eine Überpackung darstellen und nicht stabilisieren wirken)
• Durch den Austausch hydrophober SK können neue Kavitäten geschaffen werden oder bestehende vergrößert werden -> destabilisierend
• die Aufnahme von Bezol als einfaches Seitenkettenanalogon für Phe in den Hohlraum und Bindung führt zu einer Verkleinerung der Kavität. Hydrophobe Kavitätten lassen sich zur Aufnahme von Liganden durch Protein Engineering quasi maßschneidern.

5. Vereinfachte Analyse des Wegfalls eines großen Teils der SK: Ala besitzt nur funktionell weitgehend neutrale Methylgruppe; wird eine funktionelle AS gegen Ala ausgetauscht, hat dies idR einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge.

6. Vorteile: hohe Flexibilität der linearen SK (Anpassungsmöglichkeiten an sterische Randbedingungen), ähnlicher Raumbedarf wie Leucin, Isoleucin, Phe

Nachteile: geringere Transferenergie, Seitenkettenflexibilität liefer einen entropisch ungünstigen Beitrag zur Proteinfaltung und könnte zur Bildug einer molten globule Struktur Führe, instabiler als AS mit verzweigter SK, relativ reaktiv

7. 

 Zusammenlagerung unpolarer Moleküle in Wasser und wässrigen Lösungen, da Wassermoleküle in der direkten Nachbarschaft keine H-Brücken zu unpolaren Molekülen ausbilden können und sich so untereinander etwas stärker binden. → Hydrophober Effekt

Stadium bei der Hydrolyse einer Peptidbindung (katalytische Triade): Serin im aktiven Zentrum verbunden mit Carboxyterminus der gespaltenen Peptidbindung, Aminogruppe ist bereits abgespalten

ist der Prozess, bei dem eine der funktionellen Gruppen, die benötigt werden, um ein Enzym aktiv zu machen, durch das Substrat und nicht durch das Enzym selbst bereitgestellt wird. 

Entfernt man Histidin aus der katalytischen Triade Asp, His, Ser der Serinprotease Subtilisin und ersetzt es durch Alanin, wird das Enzym inaktiviert. Die Modifikation des Substrats, so dass es das His in der richtigen Position liefert, wenn das Enzym das Substrat bindet, reaktiviert das Enzym, und es kommt zur Proteolyse

His-SK an P2 des Substrats kann die Imidazolgruppe der katalytischen Triade sterisch beinahe perfekt ersetzen-> Substrat N-succinyl-Phe-Ala-His-Phe-pNitrpnailid wird bei pH 8 um den Faktor 400 schneller Hydrolysiert als das Substrat mit P2 Ala oder P2 Gln. Strategie zum Engineering von Proteasen mit besonders enger Substratspezifität.

kurze Kette, definierte Sequenz, keine definierte Raumstruktur -> Eigenschaften ergeben sich aus Summe der AS

Einzelne AS Einheit

durch Polymerisation aus einer oder wenigen unterschiedlichen AS, zufällige Sequenz, variierende Länge

Wichtig bei Grundageforschung

Längere Kette, definierte Aminosäure-Sequenz

(natürliches) Polypeptid mit definierte 3D Struktur -> biochemische Funktion 

kovalente Struktur, d.h. AS-Sequenz, sowie ggf. Disulfidbrücken und posttranslationale Modifikationen

• Konjugierte Proteine: prosthetische Gruppen (z.B. Coenzym 1)

lokale (periodische) Konformation des Rückgrats v.a. a-Helix, ß-Faltblatt

• Supersekundärstruktur: stabile Anordnung aus Sekundärstruktur- Elementen (z.B. Coiled Coils)

vollständige Raumstruktur eines Polypeptids (also eine UE) mit Wdv, Ionische WW zB Subtilisin

• Domäne: klar umrissene und in der regel stabil gefaltete Struktureinheiten (zB Zink-Fingerdomäne

räumliche anordnung von Untereinheiten bei oligomeren Proteinen 

Aufbau aus einzelnen polypeptidketten als UE (Monomere): Hämoglolbin, Streptavidin

die Grenzflächen ähneln der Packung in Inneren globuläre Proteine

bei identische monomere: zklische oder diedrische Symmetrie

Konsequenz: allosterie, unabh. davon auch Avidität

• Planet bedeckt mit Ozean (4 km tief): 1,2 * 10^18 m^3
• Darin dichte Kultur von E.coli, infiziert mit Bakteriophage M13
• maximale Replikationsrate: 3 Generationen pro Stunde
• hohe Mutationsfrequenz: jede Bakterie codiert für 1 neues Protein -> 10^55 unterschiedliche Proteine 
• vgl. Polypeptid mit 20 AS: 20^200 = 10^260 Sequenzkoombinationen
• d.h. 10^260 - 10^55 = 10^260 Proteine wurden in der Natur niemals synthetisiert

Polypeptid mit 100 As

• 20^100 = 10^130 Sequenzkombinantionen
• 10^130-10^55 Proteine wurden niemals synthetisiert
• 55: 1,3 = 42 As

• Partieller Doppelbindungscharakter
• C-N: 1,33 Å (vlg. Ca-N: 1,45 Å --> Doppelbindungscharakter)
• Ca-Ca: 3,8 Å (für alle trans-Peptidbindungen)
• Das thermodynamische GGW liegt auf Seite der Hydrolyse
• Extreme des Peptids: Carbonyl Sauerstoff: Negative partialLadnug; Amid.Stickstoff: Positive partialLadung

• Glycin
• Alanin
• Valin
• Leucin
• Isoleucin
• Prolin

Gly 

G

Nicht chiral da keine Seitenkette. Erlaubte Region im Ramachandran Plot größer

Ala

A

durchschnittlichste aller AS, beim Austausch führt nicht zum Verlust der Faltung, aber Verlust der Funktion

Val

V

Isopropylgruppe

verwendet im hydrophoben inneren des Proteins

Leu

L

Sehr häufig im inneren

Isobutyl Seitenkette

Verzweigte Struktur, stabilisiert durch spezifische hydrophobe WW -> sterische Problematik

Ganz hydrophob, voll apolar

Ile

I

Besitzt 2ter chirales Zentrum. 

Es giibt 4 chirale zentren aber in proteinogene AS kommt nur 2S und 3S vor

Pro

P

Omega Winkel von 0 Grad erlaubt. 

Iminosäure (Pyrrolidinring). Seitenkette im Ringschluss mit Stickstoff verbunden.

Aliphatisch, unpolar, hydrophob

geometrichen FG? Proliin ca 20% cis im GGW. Durch Bindungsbruch, welcher von ein Enzym katalysiert wird, und nciht durch Drehung. Sterische hinderung ist bri Pro geringer als bei anderen AS.

• Methionin
• Cystein