Bioprozesse Wenger

• Elektroporation

Bildung von hydrophilischer Poren durch kurze elektrische Impulse damit DNA eintreten kann (Zelle repariert Zellmembran)

• Lipofektion

Bildung von DNA/Liposom Komplexe --> Eintritt durch Endocytose

• Retrovirus

GS-Selektionssystem:

• Glutamin-Synthetase ist notwendig um aus Glutaminsäure und Ammoniak Glutamin zu bilden
• Zellen die GS-negtiv sind wachsen nicht auf Glutaminfreies Medium
• diese Zellen benötigen dann ein transfiziertes GS-Gen um zu überleben
• Zellen die von natur aus GS-positiv sind benötigen ein Inhibitor(MSX) (über Medium) um die zelleigenen Aktivität von GS zu inhibieren und bekommen dann ein GS-Gen über Plasmid transfiziert
• So werden nur die Zellen in Glutamin freiem Medium überleben die eine zusätzliche GS-Aktivität besitzen

DHFR Selektionssystem:

• Zellen die DHFR negativ sind wachsen nicht in Medium ohne Nukleoside (Glycin, Thymidinmonophosphat, Purine)
• Nur transfizierte Zellen mit DHFR-Gen auf Plasmid wachsen in Nukleosidfreies Medium
• schrittweise Erhöhung von MTX sorgt für Gen Rearrangement und Vervielfältigung des Gens damit diese in Gegenwart von MTX überleben können

D.h nur Zellen die hunderte Kopien von DHFR haben überleben

wird diese Gen in die selbe Kasette gelegt wie das Insert, führt MTX gleichzeitig zu einer höheren Produktivität

Screening auf hochproduzente Klone, welcher Klon produziert am meisten, Produktquantität steht hier im Vordergrund

Generierung homologer Zellpopulation die ausgewertet und später für die Produktion verwendet werden sollte

• Nachweis von Sicherheitsmerkmale z.B: Identität, Abwesenheit von infektiösen Organismen, phänotypische und genotypische Stabilität sowie Produktivität der Zellen
• Charakterisierung und Validierung einzelner Klone
• Für Reproduzierbarkeit und Etablierung in Form einer Zellbank

1. Bereitstellung von Nährstoffen in optimierter Konzentration und Verhältnis
2. Puffersystem mit ausreichende Pufferkapazität
3. Sicherstellung einer angemessenen Osmolarität & Ionenkonzentration
4. Erhalt & Neutralisierung von (toxischen) Metaboliten
5. Geeignete Schutzmittel zur Reduktion von mechanischem und oxidativem Stress, also Aufrechterhaltung bestimmter physikalischer und chemischer Umgebungsparameter (z.B pH, Osmolarität, Redoxpotential) innerhalb der Grenzwerte
6. Signalvermittlungswege die positiv für den Prozess sind z.B Wachstumfaktoren (Wachstum), chemische Induktion (Produktion) & Inhibition von Apoptose
7. Gashaushalt

• pH
  • tier. Zellen: 7,0 - 7,4
  • MO: 6,5 - 7,5 B, 2,5 - 6,5 P

Zellen geben Metabolite ab wie z.B NH₄+, Laktat/Acetat, CO₂ die den pH-Wert beeinflussen deshalb muss Medium gepuffert sein mit Hydrogencarbonat oder HEPES-Puffer

• Temperatur
  • tier. Zellen: 35° - 37°C
  • MO: 30° - 37°C B, 25° - 35°C P

Starker Einfluss auf Wachstum, Stoffwechsel, Produktivität und Löslichkeit von Mediumkomponenten

• Osmolalität
  • tier. Zellen: 260 - 320 mOsm/kg; kritisch 400 - 450 mOsm/kg
  • MO: 15 mOsm/kg - 3 Osm/kg

Zu hohe Osmolalität führt zu erhöhtes Zellvolumen und reduziertes Wachstum; zu wenig Salz --> Zellen platzen; zu viel Salz --> Zellen trocknen aus

• O₂
  • tier. Zellen: 100 - 300 rpm;OTR = 0,02g/L*h 
    (OTR=oxygen transmission rate, Rate in der O₂ im Tank verteilt wird)
  • MO: 100 - 200 rpm; OTR = 16g/L*h

• Nährstoffquelle
• Enthält Hormone und Wachstumfaktoren
• Erleichtert die Vermehrung von Zellen in adhärenter Kultur
• Bietet Schutz vor mechanischer Beanspruchung
• Enthält Proteaseinhibitoren
• Enthält Trägermoleküle (Albumin, Transferrin) für Lipide, Hormone & Spurenelemente (Eisen)
• Bindet giftige Stoffe

• undefinierte Zusammensetzung
• kann Substanzen enthalten die ein unerwünschtes Verhalten der Zellen auslösen
• der hohe Proteingehalt verhindert Downstreamprocess
• Mögliche Quelle für bekannte/unbekannte Kontaminationen

Daher wird ein Serum durch definierte und sichere Nahrungergänzungsmittel ersetzt

Kulturgefäß von Anfang an bis zum gesamten Prozessvolumen gefüllt

• einfachste Prozesssteuerung
• kein Zufüttern/Ernte während dem Prozess
• Anhäufung von Biomasse
• Anhäufung von Produkte
• Begrenzung von Substrate

-->kurze Prozessdauer und massive Veränderung in Kultur-&Prozessbedingungen

Kulturgefäß zu Beginn nur zum Teil gefüllt mit Prozessvolumen
Zugabe von konzentriertem Substrat / Medium während dem Prozess

• starke Anreicherung der Biomasse
• starke Anreicherung der Produkte
• keine Einschränkung von Substrate
• Längere Prozessdauer
• Zellen besser mit Nährstoffe versorgt
• bessere Ausbeute da erhöhte Produktbildung

Kulturgefäß wird zunächst bis zum gesamten Prozessvolumen aufgefüllt
Während Prozess wird Suspension geerntet und frisches Medium hinzugefügt

• konstante Biomasse
• konstante Produktkonzentration
• konstante Substratkonzentration
• theoretisch könnte Prozess unendlich lang gehen

Kulturgefäß wird zu beginn bis zum endgültigen PV gefüllt
Während Prozess wird frisches Medium zugeführt und gleichzeitig das alte Medium (ohne Zellen zu entfernen = Zellrückhaltung) entfernt 

• sehr starke Anhäufung von Biomasse
• Podukt kontinuierlich abgeführt
• keine Substrateinschränkung
• sehr lange Prozessdauer
• Entsorgung von Metaboliten

1. Etablierung von Zelllinie: 
   • Fokus: Zelle
   • Qualifizierung: Wachstum, Stabilität, Produktivität, Robustheit, Qualität
2. Entwicklung eines Kulturmediums:
   • Fokus: Medium
   • Konditionierung: Anpassung, Ausgleich, Umgebungsoptimierung
3. Kultivierung & Produktion
   • Fokus: Prozess
   • Implementierung: Prozessqualität, Prozesskontrolle, Design, Ausbeute, Up-Scale
4. Isolierung & Aufreinigung:
   • Fokus: Protein
   • Aufreinigung: Qualität, Ausbeute, Kapazität, Kosten
5. Formulierung:
   • Fokus: Anwendung
   • Qualität: Nutzung, Anwendung, Stabilität, Zulassung