11 MZB II - Lehner

M-Cyclin-Cdk1-Aktivität führt zu einer drastischen Reorganisation der Zelle
-> während Übergang (Pro- und Prometaphase): Chromosomen-Kondensation, Auflösung der Kernhülle, Spindelaufbau

Durch Abschalten der M-Cyclin-Cdk1-Aktivität in der Metaphase erfolgt die Reversion
->während Übergang (Telophase): Spindelabbau, Chromosomendekondensation, Aufbau der Kernhülle

durch ubiquitin-abhängige Degradation der M-Cycline

durch schnelle Aktivierung der Protease Separase, die die Cohesinringe zerschneidet, durch welche die Schwesterchromatiden zusammengehalten werden (Schwesterchromatiden-Kohäsion).

-> Cdk1 inaktiv

Cdk1 phosphoryliert neben vielen anderen Proteinen auch Untereinheiten des APC/C (Anaphase-promoting complex/Cyclosom). Nach APC/C-Phosphorylierung kann das Cdc20Protein an den APC/C binden. Der Cdc20-APC/C-Komplex erwirkt als Ubiquitinligase die Polyubiquitinierung von M-Cyclinen. Ubiquitin ist ein kleines Protein, dessen C-Terminus durch Isopeptidbindung mit -Aminogruppen von Lysinresten in anderen Proteinen verbunden werden kann. Polyubiquitinierte Proteine werden vom Proteasom abgebaut (in kurze Peptide zerstückelt). Ohne M-Cyclin kann Cdk1 keine Proteinkinase-Aktivität mehr entfalten, d.h. die zuvor von Cdk1 phosphorylierten Substratproteine werden sukzessive durch Phosphatasen wieder dephosphoryliert.

ein sorgfältig regulierter Prozess, an dem Enzyme vom E1-, E2- und E3-Typ beteiligt sind. Dank kombinatorischem Einsatz dieser Enzyme können unterschiedliche Proteine individuell gezielt beim Vorliegen von ganz bestimmten Bedingungen abgebaut werden.

Das Proteasom spaltet ubiquitinmarkierte Proteine

Endoprotease-Aktivität ist im Fass-förmigen Innern (central cylinder) des Proteasoms. Der Eingang ist mit einem Deckel verschlossen (unfoldase ring).
Polyubiquitin-Ketten wirken als Signal und erlauben Bindung an Proteine im Deckel sowie anschliessende Entfaltung der polyubiquitinierten Proteine und Einspeisung der Polypetidkette ins Fassinnere, wo der Abbau in kurze Peptide erfolgt

Viele Zellzyklusregulatoren (sowie andere Regulationsproteine) werden durch Polyubiquitinierung -> Degradation kontrolliert.
Der “rate-limiting step” ist die Erkennung und Polyubiquitinierung der Zielproteine durch Ubiquitin-Ligasen (E3-typ Enzyme)
-> CIP/KIP-Typ Cdk-Inhibitoren werden z. B. durch die Ubiquitin-Ligase SCF polyubiquitiniert, aber nur wenn die Cdk-Inhibitoren vorher phosphoryliert worden sind.

Cohesine sind Proteinkomplexe, die in der Zelle sowie bei der Mitose und der Meiose von entscheidender Bedeutung sind.

Cohesinmoleküle stabilisieren in der Zelle das Chromatingerüst und damit die dreidimensionale Struktur der Chromosomen.^[1] Während der Replikation der DNA in derS-Phase des Zellzyklus werden die beiden Schwesterchromatiden mit Hilfe der Cohesin-"Ringe" der gesamten Länge nach aneinandergebunden

Der Cdc20-APC/C polyubiquitiniert nicht nur M-Cycline sondern auch das Protein Securin

Securin bindet an Separase und inhibiert deren Proteaseaktivität. Nach Polyubiquitinierung-> Degradation von Securin: Separase wird aktiv. Sie erkennt eine Untereinheit des ringförmigen Cohesin-Komplexes und zerschneidet diese. Wegen der resultierenden Ringöffnung kann der Cohesin-Komplex die beiden identischen Schwesterchromatiden eines Chromosoms nicht mehr zusammenhalten. Die Schwesterchromatiden werden daher von der Spindel zu den entgegengesetzten Polen auseinandergezogen (Anaphase)

Der Spindelkontrollpunkt verhindert eine verfrühte Aktivierung von Cdc20-APC/C.
In der Centromerregion von Chromosomen bildet sich zu Beginn der M -Phase das Kinetochor aus. Dieser Proteinkomplex erlaubt das Anheften von Chromsomen an die Spindelfasern. Kinetochore, die noch nicht korrekt mit der Spindel verbunden sind aktivieren einen speziellen Signalweg, der als Spindelkontrollpunkt bezeichnet wird. Der aktivierte Signalweg führt zur Produktion von Inhibitoren (Mad2-BubR1-Bub3-Cdc20-Komplexe) die Cdc20-APC/C inhibieren. Die Zelle kann daher erst mit der Anaphase beginnen, nachdem alle Chromosomen richtig in der Spindel integriert worden sind.

lebende Zellen isolieren
->in Zellkultur vermehren
 ->Zellen in Mitose arretieren: Zugabe von Spindelgiften (z.B. Colchicin) zum Kulturmedium führt zur Aktivierung des Spindelkontrollpunktes und somit zu Zellzyklusarrest in der Mitose.
   ->mitotische Zellen auf Objektträger lysieren
    ->mikroskopische Charakterisierung der Chromosomen (nach Färbung oder FISH: Fluoreszenz in situ Hybridisierung) Kopienzahl von Autosomen und Geschlechtschromosomen, Chromosomenstruktur: Deletionen, Duplikationen, Translokationen

Nach der Mitose, in der G1 Phase kann die replikative Helikase (Mcm2-7) an die Replikationsursprünge rekrutiert werden (mit Hilfe von ORC, Cdc6 und Cdt1), weil in dieser Zellzyklusphase keine Cdk-Aktivität in der Zelle vorhanden ist.

Die Aktivierung der Helikase (und damit die Initiation der DNA-Replikation) erfolgt jedoch erst, nachdem in der Zelle S-Cyclin-Cdk-Aktivität (und die Aktivität einer weiteren Proteinkinase, DDK) exprimiert worden ist.

S-Cyclin-Cdk-Aktivität bewirkt nicht nur die Initiation der DNA-Replikation, sondern verhindert gleichzeitig auch, dass die Helikase noch einmal an bereits genutzte Replikationsursprünge rekrutiert werden kann. Reinitiation wird also verhindert (u.a. durch Phosphorylierung von Cdh1, was zur Inhibition des Cdh1-APC/C-Komplexes und damit zur Akkumulation des Cdt1-Inhibitors Geminin führt).

Erst nach der Mitose, kann in der nächsten G1Phase im folgenden Zellzyklus wieder Helikase an den Ursprung rekrutiert werden (nach mitotischer Degradation von Geminin nach Polyubiquitinierung durch Cdc20-APC/C)

DNA-Schäden verhindern in Säugerzellen auch den Eintritt in die S-Phase (nicht nur den Eintritt in die M-Phase)

in normalen Zellen ist p53 unstabil. Es wird durch die Ubiquitinligase Mdm2 erkannt, polyubiquitiniert und daher degradiert.
•DNA Schäden führen zur Aktivierung von Proteinkinasen (ATR, ATM, Chk1, Chk2) welche p53 und Mdm2 phosphorylieren. Dadurch wird die p53-Polyubiquitinierung verhindert. p53 akkumuliert, bildet Tetrameren und wandert in den Zellkern.
•Im Zellkern wirkt p53 als Transkriptionsfaktor und aktiviert die Expression von Zielgenen wie z.B. das Gen für den CIP-Typ Cdk-Inhibitor p21. p21 inhibiert G1-und S-Cyclin-CdkKomplexe und inhibiert somit den Eintritt in die S-Phase.
•Bei sehr starken DNA-Schäden und entsprechend starker p53-Aktivierung kann p53 ein Zell-Suizidprogramm (Apoptose) anschalten

• Bindung von Insulin oder IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) an den Insulin-Rezeptor (Inr) aktiviert den Signalweg.
•Eine Lipid-Kinase (PI3K) und die Proteinkinase (TOR: Target of Rapamycin) sind wichtige Elemente in diesem Signalweg.
•Die Lipid-Phosphatase PTEN ist der Gegenspieler von PI3K.

Die wichtigsten Tumorsuppressorgene sind p53, Rb und PTEN
-> p53, Rb und/oder PTENFunktion fehlt in den meisten Tumorzellen, weil sich in den entsprechenden Genen somatische Mutationen ergeben haben
  -> PTEN-Verlust beschleunigt das Zellwachstum
  -> Rb-Verlust beschleuigt die Zellzyklusprogression
  -> p53-Verlust führt zu einer erhöhten Mutationsrate (genetische Instabilität) und ausserdem können sich die geschädigten Zellen nicht mehr durch Apoptose entsorgen

-> Überlebensfähigkeit unabhängig von normalerweise erforderlichen extrazellulären Signalen (Überlebensfaktoren)
-> Zellwachstum und Zellvermehrung auch in Abwesenheit der normalerweise nötigen extrazellulären Signale (Wachstumsfaktoren, Mitogene), auch über die HayflickGrenze hinaus (keine replikative Seneszenz, Telomerase aktiv)
-> resistent gegen extrazelluläre Faktoren, die normalerweise Zellvermehrung hemmen und Differenzierung fördern
-> Organisation einer Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen (Angiogenese: Blutgefässbildung)
-> Umgehung von Immunabwehr -> Fähigkeit zum Auswandern und kolonisieren anderer Gewebe (Metastasierung)

=> Akkumulation all der erforderlichen Mutationen wird beschleunigt durch Mutationen, die bewirken, dass die Regulation der Progression durch den Zellzyklus nicht mehr korrekt funktioniert -> erhöhte genetische Instabilität

Die Komponenten, die für das zelluläre Überleben nötig sind, werden vermehrt, so dass ausreichend Material für zwei neue Tochterzellen zur Verfügung steht. Insbesondere die genetische Information, die in Form von DNA in den Chromosomen gespeichert ist, muss durch DNA-Replikation exakt verdoppelt werden. Der Abschnitt der Interphase, in der die chromosomale DNA repliziert wird, wird als S-Phase bezeichnet (S für DNA-Synthese). Der davor bzw. der danach folgende Abschnitt wird als G1- bzw. G2-Phase bezeichnet (G für Gap)

Die Zell-Bestandteile werden auf zwei Tochterzellen verteilt. Zuerst werden die beiden exakten Kopien der genetischen Information (die beiden Schwesterchromatiden eines jeden Chromosoms) in der Mitose voneinander getrennt. Die Mitose wird in verschiedene Phasen unterteilt (Pro-, Prometa-, Meta-, Ana-, Telophase). Anschliessend erfolgt die eigentliche Zellteilung (Cytokinese) der Vorläuferzelle in zwei Tochterzellen

bei menschlichen Zellen in Zellkultur durchschnittlich G1 = 12 h, S = 6 h, G2 = 6 h, M = 40 min, insgesamt 24 h, im Körper je nach Zelltyp zum Teil sehr unterschiedliche Geschwindigkeiten

s.B.

Als Primärkultur bezeichnet man eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde.
-> genetisch normale Zellen
  -> bestenfalls begrenzte Vermehrung von bestimmten
Zelltypen in Kultur, bei den meisten differenzierten Zelltypen keine Vermehrung

Wenn die Vermehrung bei der sogenannten Hayflick-Grenze angekommen ist, werden Zellen seneszent. Sie vermehren sich dann auch in optimalem Wachstumsmedium nicht mehr weiter (replikative Seneszenz). Zum Teil entwickelt sich replikative Seneszenz in Folge von Telomer-Verkürzung wegen fehlender Telomerase-Aktivität in somatischen Zellen. In Tumorzellen wird Telomerase-Aktivität meistens auf Grund von somatischen Mutationen reaktiviert. Telomer: spezielle DNA-Sequenzen und assoziierte Proteine an den Enden der Chromosomen.

Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können
-> unbegrenzte Vermehrung in Kultur (immortalisiert, transformiert) auf Grund von unbekannten oder bekannten genetischen Veränderungen (z.B. Reaktivierung von Telomerase, …)

in Suspension (im Kulturmedium schwimmend)
adhärent (auf dem Boden der Kulturschale ausgebreitet)

mesenchymal (z.B. Fibroblasten aus der Dermis)
epithelial (z.B. Keratinozyten aus der Epidermis)

Konfluenz: Zellen haben sich soweit vermehrt, dass die ganze Kulturschale von Zellen bedeckt wird.

Kontaktinhibition: Zellproliferationsstopp, der bei einigen Zelltypen in Folge von Konfluenz eintritt.

Passagieren: Die konfluenten Zellen werden von der Kulturschale abgelöst. Ein Teil davon wird in eine frische Kulturschale gegeben zur weiteren Vermehrung..

asynchrone Zellen:
Gemisch von G1-, S-, G2- und M-Phasen-Zellen.
(Falls der Zellzyklus = 24 h und G1 = 12 h, S = 6 h, G2 = 6 h, sowie M = 40min dauert, dann sind 50% der Zellen im Gemisch in G1, 25% in S, 25% in G2 und 2.8% in M.)

synchrone Zellen:
idealerweise 100% in entweder G1, S, G2 oder M

Induktionsmethoden: Synchronie wird erzwungen (induziert)

- durch Zugabe von Inhibitoren, die einen Zellzyklusarrest bewirken, z.B.:
  - Colchicin, Taxol (Mikrotubuli-Inhibitoren, Spindelgifte): -> Arrest in M
  - Aphidicolin (inhibiert DNA polymeraseα): -> Arrest zu Beginn der S-Phase

- durch Entzug von Serum/Wachstumsfaktoren/Mitogenen:
  -> Arrest in G1 (am sogenannten Restriktionspunkt, restriction point)

- durch Befruchtung gefolgt von synchronen Furchungsteilungen in bestimmten Invertebraten und Amphibien (Xenopus, Seeigel, Miesmuschel)

Selektion von Zellen in definierter Zellzyklusphase aus asynchroner Zellpopulation:

- durch Abschütteln (shake off) von abgerundeten mitotischen Zellen bei adhärent wachsenden Zelllinien

- mit „fluorescence-activated cell sorter (FACS)“: nach DNA-Färbung aussortieren von G1-, S-, oder G2/M-Zellen

FACS Fluorescence-activated cell sorting Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

Messung der Fluoreszenz-Signalintensität einzelner Zellen

Nach DNA-Färbung mit Fluoreszenzfarbstoff kann das Zellzyklusprofil (Histogramm) einer Zellpopulation bestimmt werden

Flächenintegration unter den Peaks: -> Bestimmung des Anteils von Zellen in der Population, die sich gerade in der G1-, S- bzw. G2/M-Phase befinden. Unter Annahme eines einheitlichen Zellverhaltens kann daraus die Länge der G1-, S- und G2/MPhase bestimmt werden, wenn vorher schon die Verdoppelungszeit bestimmt worden ist (durch Messung des zeitlichen Verlaufs der Zellzahl)

ausserdem ebenfalls informativ:
- sub-G1-Peak: apoptotische Zellen
- forward scatter (FSC): ein Mass für Zellgrösse