M3 Molekulare Klonierung
Mikrobiologie
Mikrobiologie
Kartei Details
| Karten | 37 |
|---|---|
| Sprache | Deutsch |
| Kategorie | Biologie |
| Stufe | Berufslehre |
| Erstellt / Aktualisiert | 09.02.2015 / 15.02.2015 |
| Weblink |
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Nennen Sie drei verschiedene Arten von natürlich vorkommenden Plasmiden.
Beschreiben Sie kurz die biologische Bedeutung von R-, F- und Degradations-Plasmiden.
- Resistenzplasmide: Vermitteln den Bakterien Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum/ eine bestimmte Klasse von Antibiotikum.
- Degradationsplasmide: Ermöglichen den Abbau ungewöhnlicher Substanzen.
- Fertilitätsplasmide: Ermöglichen die Ausbildung eines Sex-Pilus zum horizontalen Gentransfer.
Ihre Plasmid-DNA soll mit Kpn1 geschnitten werden. Sie liegt in der Konzentration 2,5mikro'g/mikroL vor. Kpn1 hat eine Aktivität von 5u/mikroL. Sie möchten 15mikro'g Plasmid-DNA in 120 min. bei 37°C schneiden.
Stellen Sie einen Restriktionsansatz zusammen, der ein Endvol. von 30mikroL hat.
DNA: 2,5mikro'g/mikroL
=> 15mikro'g : 2,5mikro'g/mikroL = 6mikroL
Kpn1: 5u/mikroL ; 1u schneidet 1mikro'g DNA pro h
> 15u Kpn1 schneideen also 15mikro'g DNA in 1h
-> 7,5u Kpn1 schneiden 15mikro'g DNA in 2h
=> 7,5u/ 5u/mikroL = 1,5mikroL
Puffer: 10xPuffer -> 30mikroL :10= 3mikroL
Wasser: 30mikroL - 6mikroL - 1,5mikroL - 3mikroL = 19,5mikroL
Zeichnen Sie einen Plasmidvektor, der alle nötigen Eemente für die molekulare Klonierung mit der Selektion der Klone durch Blue/White-Screening enthält.
ORI
Promotor
LacZ
MSC
amp-Resistenz
Erläutern Sie die Funktion der Elemente eines Plasmidvektors für die molekulare Klonierung (mit Selektion der Klone durch Blue/White-Screening).
1)ORI - hier startet die Replikation des Plasmids. Ein effizienter Ori produziert viele Kopien des Plasmids.
2)Promotor - Signatsequenz => Startsequenz
3)LacZ -> das LacZ-Gen ist das Lac-Operon von E.coli. Es ist für das Blue/White-Screening esentiell. Wenn das Gen intakt ist wird ß-Galaktosidase hergestellt und ein blauer Farbstoff entsteht; die entsprechenden Zellen erscheinen blau. Falls das Gen aber durch ein Insert unterbrochen sein sollte wird der Farbstoff nict gebildet und die Kolonie erscheint weiß.
4)MSC = synthetischer DNA-Abschnitt, auf welchem sehr viele Schnittstellen für Restriktiondenzyme liegen. An dieser Stelle können Insert eingebaut werden.
5)amp-Resistenz - ist nötig für die Selektion der Bakterien, die das gewünschte Plasmid aufnehmen. Die Bakterien ohne Plasmid können sich auf einem 2amp.-Medium" nicht vermehren.
Sie schneiden ein lineares DNA-Fragment mit EcoR1 allein sowie mit EcoR1 und BamH1 gemeinsam in einem Doppelverdau. Sie erhalten dabei folgendes Bandenmuster (Bild).
Wählen Sie dienjenigen Bandenmuster aus, die Sie erwarten können, wenn Sie die DNA mit BamH1 verdauen.
Das RE Pvul ist gut geeignet für die Anwendung in der molekularen Klonierung. Im Folgenden sehen Sie versch. DNA-Sequenzen.
Welcher dieser DNA-Sequenzen entspricht der Enzymsequenz für dieses gentechnisch häufig verwendete RE?
Welcher dieser DNA-Sequenzen entspricht der Enzymsequenz für Sma1?
Welcher dieser DNA-Sequenzen entspricht der Enzymsequenz für EcoR1?
Welcher dieser DNA-Sequenzen entspricht der Enzymsequenz für BamH1?
Welcher dieser DNA-Sequenzen entspricht der Enzymsequenz für Hind3?
|) Welche Aussage über die Konformation von Pasmiden trifft NICHT zu?
||) Welche Aussage über die Konformation von Pasmiden trifft NICHT zu?
Die zur molekularen Klonierung verwendeten Bakterien unterscheiden sich von den ursprünglichen Wildtyp-Bakterien. Nennen Sie einen Laborstamm und beschrieben Sie drei Merkmale, die ihn von einem Wildstamm unterscheiden.
Escherichia Coli K12 - Derivate (z.B. E-coli XL1-Blue)
- keine Methylasen
- keine Recombinasen
- keine RE
Nennen Sie die Definition für "Plasmid".
= doppelsträngige, zirkuläre, (kleine [1000 - 20000bp]) extrachromosomale DNA
Nennen Sie fünf Hauptklassen von Plasmiden.
- Fertilitäts-Plasmid (F-Plasmid)
- Resistenz-Plasmid (R-Plasmid)
- Degradations-Plasmid
- Virulenz-Plasmid
- Col-Plasmid
Nennen Sie drei Strukturelemente, die auf einem Plasmid wie pBluescript - SK (+) enthalten (codiret) sind.
MSC (Multiple Cloning Site)
ORI (Origin of Replication)
ampr (Ampicilinresistenz)
Nennen Sie drei Strukturelemente, die auf einem Expressionsvektor wie pcDNA3 enthalten sind und nicht auf einem einfachen Plasmid, wie pBluescript-SK(+) vorkommen.
-eigener Promotor für die Transkription
-eigene Regulationssequenzen (AAAA & Terminator) für die Translation des Inserts
-weitere Selektivmarker (z.B. Tetraglycin-Resistenz)
Sie haben eine Plasmidpräparation nach der Vorschrift das Herstellers mittels Anionenaustauschchromatographie durchgeführt.
Im letzten Schritt eluieren Sie ihr Pasmid mit 100mikroL TrisCl (c=10 nmol/L, pH=8) von der Säule. Der Hersteller gibt an, dass die Säue maximal 120mikroL Plasmid-DNA binden kann.
Sie möchten nun eine Bestimmung der Konz. des Plasmids mittels Photometer durchführen.
Die Küvette, dir Ihnen zur Verfügung steht, hat ein Mindestvol. von 150 mikroL.
Sie würden am liebsten bei 260nm Wellenlänge einen Messwert von 0,1 erhalten.
Berechnen Sie wie Sie ihr Plasmid-Eluat für die Messung verdünnen: Wie viel mikroL von welcher Lösung müssen für die OD-Messung zusammenpipettiert werden?
max. 100mikroL = 120mikro'g DNA
mind. 150mikroL
Wunsch: ???
Was ist ein Restriktionsenzym?
= bakterielle Enzyme, die DNA an bestimmten Stellen (Erkennungssequenzen => Palindromen) scheiden können
Welche verschiedenen Klassen von RE gibt es?
Es gibt zwei verschiedene Klassen:
1) schneiden kohärent/ versetzt => Bildung von sticky ends
2) schneiden glatt => Bildung von blunt ends
Was ist eine Ligase?
= Enzym, dass die Reaktion zwischen dem 3'OH- und dem 5'-P-Ende der DNAs katalysiert.
So erhält man als Produkt ein Plasmid mit fremder, integrierter DNA
Wie kann man fremde DNA in Bakterien einbringen? Erläutern Sie zwei verschiedene Mechanismen.
- Hitzeschock (/CaCl2-Behandlung) 106-108 cfu/mikro'g DNA
Kompetente Zellen (aus log. Wachstumsphase) + DNA
-> Inkubation auf Eis
-> Hitzeschock 42°C*
-> Zugabe von LB-Medium
-> 1h Inkubation bei 37°C, dann ausplattieren
- Elektroporation (Salzfrei) 108-1010 cfu/mikro'g DNA
Kompetente Zellenin H2O resuspensieren
-> Bakterien + DNA
-> Elektroschock in einer Elektroporationsküvetten*
-> Zugabe von LB-Medium
-> 1h Inkubation bei 37°C, dann ausplattieren
* Zellmembran wird permeabel und kann DNA aufnehmen
Was passiert mit der DNA im Empfängerbakterium?
Erläutern Sie den Restriktionsmechanismus.
1) Bildung eines Enzym-Nukleotid-Intermediats
AS wird auf Aminogruppe der Lysin-Seitenkette übertragen
2) Übertragung des AMP auf's 5'-P-Ende des offenen DNA-Stranges
3) Bildung der Phsophordiesterbindung durch 3'-OH-Gruppe mit aktivierter 5'-P-Gruppe
-> AMP wird freigesetzt
Welche Faktoren beeinflussen wie ein Molekül DNA im Agarosegel wandert?
Wie sieht der Ablauf einer molekularen Klonierung aus?
1) Präparation: mit RE=> Insert + Vektor
2) Ligation: mit Hilfe einer Ligase => recombiniertes Plasmid
3) Transformation: Schocktherapie => Einbringen des Plasmids in kompetente Bakterien
--> anschließende Vervielfältigung durch Plasmidreplikation und Zellvermehrung
4) Kontrolle/ Selektion: ausplattieren=> recombinierte Klone
Wenn wir im Labor mit R-Plasmiden arbeiten, arbeiten wir mit abgeleiteten R-Plasmiden.
Was bedeutet das?
Welche zwei Möglichkeiten der Präparation gibt es?
1) gerichtete Kolnierung mit 2 verschiedenen RE
=> Ligation des Inserts ist nur in einer Orientierung möglich. Religation des vektros ist nicht möglich
2) ungerichtete Kolnierung mit nur einem RE
Wie kann ich eine RE-Erkennungssequenz synthetisch an mein Insert bzw. meinen Vektor anbringen?
In dem ich während einer PCR einen modifizierten Primer herstelle
Erläutern Sie das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
(Beginnend mit einer Übernachtkultur)
1) Übernachtkultur (im Eppi) runterzentrifugieren
2) Überstand verwerfen und Pellet in einem neut. Puffer (Sol.1) resuspensieren
3) Zellyse durch Sol. 2 (NaOH + SDS)
-> SDS ist 'n isotonisches Detergenz, zerstört Zellmembran
-> NaOH erzeugt alk. pH-Wert, chromosomale DNA denaturiert
4) Neutralisation durch Kaliumacetat/ Essigsäure (Sol.3)
-> KaliumAc bildet mit dem SDS unlösliche Komplexe, an denen chromosomale DNA & Proteine hängen bleiben; chaotrophe Salze entziehen den Plasmiden die Hydrathülle
5) unlösliche Komplexe runterzentrifugieren -> Plasmide im Überstand
6) Überstand in Silikasäule aufreinigen:
--> Bildung von Kationbrücke zwischen Silicamembran & DNA
-> WASCHEN und Durchfluss verwerfen
-> DNA mit Elutionspuffer o. ddH2O eluieren (niedriger Salzgehalt, Na+-Brücke wird aufgelöst)
7) abzentrifugeren => Plasmid-DNA im Durchfluss
|) Das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
besteht aus mehrern Schritten. Erläutern Sie was im dritten Schritt geschieht?
3) Zellyse durch Sol. 2 (NaOH + SDS)
-> SDS ist 'n isotonisches Detergenz, zerstört Zellmembran
-> NaOH erzeugt alk. pH-Wert, chromosomale DNA denaturiert
||) Das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
besteht aus mehrern Schritten. Erläutern Sie was im vierten Schritt geschieht?
4) Neutralisation durch Kaliumacetat/ Essigsäure (Sol.3)
-> KaliumAc bildet mit dem SDS unlösliche Komplexe, an denen chromosomale DNA & Proteine hängen bleiben; chaotrophe Salze entziehen den Plasmiden die Hydrathülle
|||) Das Methodenprinzip der Plasmid-DNA-Isolation mittels Anionenaustauscherchromatographie.
besteht aus mehrern Schritten. Erläutern Sie was im sechsten Schritt geschieht?
6) Überstand in Silikasäule aufreinigen:
--> Bildung von Kationbrücke zwischen Silicamembran & DNA
-> WASCHEN und Durchfluss verwerfen
-> DNA mit Elutionspuffer o. ddH2O eluieren (niedriger Salzgehalt, Na+-Brücke wird aufgelöst)
Difinieren Sie den Begriff Transformationseffizienz.
= bei wie viele Bakterien bzw. cfu's die Einschleusung von DNA erfolgreich war.
-> Wird in cfu/ mikro'g DNA angegeben
Nach einer Transformation und Inkubation von Bakterien über Nacht bei 37°C erhalten Sie 55 Koloien auf 1/4 Ihrer LB-Amp-Agarplatte.
Transformationsansatz: Supercoiled Plasmid-DNA (c= 850mikro'g/mL), 1:100 verdünnt, davon 5 mikoL eingesetzt. Kompetente Zellen: 100 mikroL E.coli
Berechnen Sie die Transformationseffizienz Ihrer komponenten Zellen und beurteilen Sie diese.
55cfu x 4 = 220 cfu
850mikro#g/mL ; 1:100 -> 8,5mikro#g/mL = 8,5x10-3mikro#g/mikroL
8,5x103mikro#g/mikroL x 5mikroL = 0,0425mikro#g DNA
Transformationseffizienz: 220cfu/ 0,0425mikro#g = 5176cfu/ mikro#g DNA
-> eine Te. von ca. 5x103 ist sehr gering. Bei der Hitzeschockmethode sollte Sie bei 106- 108, bei der Elektroporation sogar bei 108- 1010 liegen.
Nennen Sie zwei Subsatnzen, die beim Blue/White-Screening zusätzlich eingesetzt werden und ihre Funktion.
X-Gal ist ein Substrat, das von der ß-Galaktosidase gespalten (hydrolysiert) wird, dabei entsteht ein blauer Farbstoff.
IPTG ist ein Indujtor für das Lac-Z-Gen. Es bindet an den Repressor und inaktiviert ihn so. Die Transkription des Gens kann dann starten.
