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Transformation, Transduktion, Transfektion
Transformation, Transduktion, Transfektion
Kartei Details
| Karten | 14 |
|---|---|
| Sprache | Deutsch |
| Kategorie | Biologie |
| Stufe | Universität |
| Erstellt / Aktualisiert | 26.06.2016 / 22.02.2018 |
| Weblink |
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Wozu dient Transformation?
Aufnahme von freier DNA aus der DNA durch Bakterien
--> Einbau von DNA ins Genom ---> Veränderung des Phänotyps
Wozu dient Tranduktion?
Übertragung von DNA von Bakteriophagen oder Viren in ein Bakterium
über Zelleigenen Replikationmaschinerei vermehrt --> Virus Partikel hergestellt und mittels Zelllyse freigesetzt
Wozu dient Transfektion?
Aufnahme von DNA in Säugertierzellen
Was bedeutet transient und stabil?
transient
- nicht in Wirts-DNA eingebaut
- Expression nur kurzzeitig
- wird bei Zellteilungen ausgewaschen
- große Anzahl an Proben in kurzer Zeit
stabil
- ins Genom eingebaut
- stabil, aber geringere Effizienz
Was bedeutet Kompetenz der Zellen?
Die Fähigkeit einer Zelle DNA aus der Umgebung aufzunehmen.
Kann natürlich sein, muss aber meist im Labor durch physikalische oder chemische Methoden induziert werden (auch E.coli)
Was bedeutet Transformationseffizienz?
Ist ein Maß für die Kompetenz der Zellen. = die Anzahl der Kolonien pro 1μg eingesetzte DNA.
Unter optimalen Bedingungen: 106-107 Kolonien pro 1μg eingesetzter Plasmid-DNA
Welche Transformationsmethoden gibt es?
- chemische Transfomation (durch CaCl2)
- Elektroporation
Wei funktioniert chemische Kompetent-Machung?
genauer Mechanismus noch nicht geklärt
- Durch Zugabe von CaCl2 kompetent gemacht (Ca2+ Ionen schwächen negative Ladungen der DNA ab --> Annäherung an ebenfalls negativ geladene Zellmembran)
- DNA hinzugegeben
- ~30min auf Eis inkubiert
reduziert thermische Bewegeung --> DNA kann leichter ansetzen - 2 minütiger Hitzeschock bei 42°
plötzliche Änderung der Fluidität der Membran (leichter durchlössig) + Sogwirkung durch Temperatur-Unterschied innen und außen
Wie funktioniert Elektroporation?
Effektivste Methode (107 – 1010 Kolonien pro 1μg eingesetzter Plasmid-DNA) --> Herstellung von Genbanken
Elektrischer Impuls macht die Zellmembran kurzzeitig durchlässig für DNA in dem es durch eine Konformationsänderung Poren in der Membran öffnet
- Kolonien wachsen lassen
- Abkühlen
- Zentrifugieren
- Mit eiskaltem Puffer oder Wasser waschen (mindert die Ionenstärke, verhindert später elektrischen Durchschlag)
Muss für jeden Zelltyp neu optimiert werden.
Problem: Salzkonzentrationen der Vektorpräparation kann Elektroporation stören. Reinigung durch Chlor/Phenol-
Extraktion oder Alkoholfällung (aber DNA Verlust)
Wie kann Transfektiert werden?
Durch Mikroinjektion
Mit feiner Glaskapillare wird DNA in Zelle (z.B. Eizelle) oder direkt in den Zellkern eingeschleust
Zur Herstellung transgener Tiere
Was bedeutet Selektion und Screening?
SELEKTION
Ob Plasmid-DNA auch wirklich aufgenommen wurde. = Effektivität der Transformation. Mit Hilfe von Antibiotika-Resistenzen
SCREENING
Welche der Zellen hat ein Plasmid mit Insert aufgenommen = Effektivität der Klonierung.
Insertion des Target Gens unterbricht ein Reporter-Gen --> kein vollständiges Protein mehr erzeugt --> kann nachgewiesen werden
z.B. Blau-Weiß-Selektion
Plasmid enthält Gen für β-Galactosidase, die normalerweise XGal unter Produktion eines blauen Farbstoffs abbauen würde --> Gen unterbrochen --> kein Enzym --> keine blaue Farbe
Welche positiv Kontrollen gibt es?
- Zellen mit dem ungeschnittenen Vektor tranformiert
- Zählen der Kolonien
- Transformationseffizienz ermittelt
Bei eigentlichem Versuch kann dann beobachtet werden, ob das Insert die TE beeinflusst
Welche negativen Kontrollen gibt es?
Auftragen von Zellen auf das Medium ohne Fremd-DNA (nicht transformiert)
--> Es sollten keine Kolonien wachsen, da keine Resistenzen vorhanden sind (wären auf dem Plasmid)
Ursachen wenn trotzdem etwas wächst:
- Bakterienzellen oder Reagenzien könnten mit resistentem Stamm kontaminiert sein
- Selektionsplatte könnte Störung haben: Antibiotikum vergessen oder in zu heißes Agar gegeben
- Selektionsplatte mit resistentem Stamm kontaminiert
Wozu wird Transformiert?
- Klonierung und Vervielfältigung von Plasmiden bzw. DNA Fragmenten
- Produktion von Proteinen
