Genetik

Die nächste wichtige Erkenntnis war, dass die vier Basen der Erbsubstanz immer gepaart vorkommen, das heisst das
Nuklein enthält immer gleiche viel Thymin (T) wie Adenin (A), und die gleiche Menge Cytosin (C) wie Guanin (G).

Diese Verhältnisse werden „Chargaff Regeln" nach ihrem Entdecker Erwin Chargaff genannt.

• Infektion mit Pneumokokken des S-Stammes (smooth)     --> tötet die Mäuse!
• Infektion mit Pneumokokken des R-Stammes (rough)     ---> tötet die Mäuse nicht!
• Injektion mit abgetöteten Pneumokokken des S-Stammes (smooth)     --> tötet die Mäuse nicht!
• Injektion mit abgetöteten Pneumokokken des S-Stammes (smooth) und mit Pneumokokken des R-Stammes     --> tötent die Mäuse!
   ---> WARUM sterben die Mäuse bei der letzten Variante?
   * R-Bakterien nehmen Bruchstücke auf
   * tödliche Eigenschaft von Smooth wird auf Rough übertragen

nukleäre DNA & mitochondriale DNA

• Anzahl "Nur RNA Gene": mind. 3‘000
• Grösse: ~2.8 Mrd. Basenpaare (bp)
• Anzahl Gene: 20‘000 – 25‘000
• Gendichte: 1 Gen auf 130‘000 bp
• Gengrösse im Ø ca. 27‘000 bp
• Exons pro Gen im Ø: 9 (1-363)
• Exongrösse im Ø: 120 bp (10-7600 bp)
• lineares doppelsträngiges Molekül
• Kopien in diploider Zelle: 2
• Kopien in haploider Zelle: 1

• Grösse des Genoms: 16‘569 (bp)
• Anzahl Protein-kodierenden Gene: 13
• Anzahl Transfer-RNAs-kodierender Gene: 22
• Anzahl Ribosomaler-RNAs-kodierender Gene: 2
• Zirkuläres doppelsträngiges Molekül
• Kopien in einem Mitochondrium: 2-10
• Mitochondrien pro Zelle: 1‘000 – 100‘000
• maternale Vererbung

* DNA enthält Abkömmlinge der heterozyklischen Verbindungen Purin und Pyrimidin, die auch als Basen, Stickstoff- Basen oder Nukleobasen bezeichnet werden.
* Die zwei Purin-Abkömmlinge sind Adenin (A) und Guanin (G); die Pyrimidin-Abkömmlinge sind Thymin (T), Cytosin (C).
* 4 Bausteine

Diese Basen liegen in der Form sogenannter Nukleoside vor , d.h. in Verbindung mit dem Pentose-Zucker Desoxyribose. Man nennt sie daher Desoxy-Nukleoside. Sie sind Bestandteil von DNA. Die Pentose ist mit der Base über eine N-glykosidische Bindung verknüpft. Eine freie Hydroxyl-Gruppe der Zucker-Komponente in einem Nukleosid kann mit einem Phosphat-Rest verestert sein. Die Phosphat-Gruppe kann in verschiedenen Positionen (3´ oder 5´) sitzen. Die durch Veresterung entstehenden Nukleosid-Mono-, Di- und Triphosphate nennt man Nukleotide.

Chemisch handelt es sich bei DNA um ein unverzweigtes, hochmolekulares Polymer aus Nukleotiden, die über eine Phosphodiester-Bindung zwischen den Phosphat-Resten am 3. und 5. Kohlenstoff-Atom der Desoxyribose miteinander verknüpft sind.
Ein Polymerstrang hat jeweils ein 5´-Phosphat- Ende und ein 3´-Hydroxyl-Ende und damit eine definierte Orientierung. Langkettige Moleküle aus einzelnen Nukleotiden bezeichnet man als Polynukleotide, kurzkettige (<20-30 nt) als Oligonukleotide.
Nach der Konvention werden DNA-Sequenzen immer von links nach rechts geschrieben, wobei links mit dem 5’-Ende begonnen wird.

Mit Ausnahme der DNAs einiger Viren besteht das Genom der meisten Organismen aus doppelsträngiger DNA, in der zwei DNA-Einzelstränge zu einem Doppelstrang zusammengelagert sind.
Nur C und G oder A und T können einander gegenüber liegen (komplementäre Basen). Zwischen C und G werden drei, zwischen A und T werden zwei Wasserstoffbrücken gebildet (Basenpaarung).

Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen in einem doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül sind relativ schwach.
Zusätzlich spielen Van-der- Waals-Kräfte und hydrophobe sowie elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle bei der Stabilisierung der Nukleinsäure-Moleküle.

Experimentell können DNA-Doppelstränge durch chemische Einwirkung (z.B. Alkali,  Formamid oder Harnstoff) oder durch Erhitzen voneinander getrennt werden (Denaturierung).
Beim Abkühlen können sich komplementäre Nukleinsäure-Stränge wieder zum doppelsträngigen Molekül vereinigen (Renaturierung oder Hybridisierung). Dieses Prinzip nutzt man, um die Anwesenheit bestimmter Nukleinsäure- Sequenzen durch Hybridisierung mit markierten komplementären Sequenzen (Sonden) nachzuweisen

2n = 6 x 10-12g/Kern = 6 Pikogramm/Kern
2,74 x 109 Basenpaare
~2 m Länge
Männer (XY) haben etwa 1,6% weniger DNS als Frauen (XX)
Bei höheren Organismen ist ein grosser Teil der DNS nicht kodierend (Mensch ~97%!!)
Mikrogramm (10-6 Gramm)
Nanogramm (10-9 Gramm)
Pikogramm (10-12 Gramm)
Femtogramm (10-15 Gramm)
Attogramm (10-18 Gramm)

Eubakterien >500 Spezies vollständig sequenziert
z.B. Escherichia coli 4.64 Mb 4 400 Gene
z.B. Mycoplasma genitalium 0.58 Mb 500 Gene
Archaebakterien 46 Spezies vollständig sequenziert
 --> Genome kompakt
 --> keine Introns
 --> fast nur kodierende Sequenz
 --> DNA ringförmig, frei in der Zelle (kein Zellkern, kein Chromatin, keine Chromosomen)

Spezies                          Chromosomen - Genomgrösse - Zahl der Gene
                                         (haploid)
Sacharomyces cerevisiae   16                13 Mb             6 500
Caenorhabditis elegans       6                  97 Mb          20 000
Drosophila melanogaster    5                   180 Mb          13 500
Arabidopsis thaliana            5                   125 Mb          26 000
Homo sapiens                     23                 3000 Mb        25 000 „finished sequence“
weitere Säuger: Maus, Ratte, Schimpanse, Hund, Rind, Pferd „ sequence“
Gallus gallus (Huhn)          39                   1100 Mb          20 000
Oryza sativa (Reis)            12                    420 Mb          50 000
weitere Sequenzierprojekte: Schwein, Rhesusaffe, Katze, Opossum, Schnabeltier, etc.

Humanes Genom (Nature 409, 860-921, 2001 & Nature 431, 931-945, 2004)
~ 3 x 109 bp
~ 25 000 Gene
~ 20 000 Pseudogene
repetitive DNA ~ 50 %   ---> repetative Sequenzen
Repetitive DNA    -  Kopien im Genom  -   Anteil an der Genomsequenz
SINE (z.B. Alu)             1 558 000               14 %         --> Seq. aus eigenen Zellen kopiert & in DNA eingesetzt
LINE (z.B. Line1, Line2) 868 000                21 %         --> ursprüngliche, virale DNA
Sonstige “interspersed repeats”  300 000          13 %
Dinucleotid-Repeats      130 000                 0.4 %        --> genetischer Marker
Trinucleotid-Repeats       35 000                 0.1 %        --> genetischer Marker
Tetranucleotid-Repeats   97 000                 0.2 %        --> genetischer Marker

In der Genomsequenz fehlen häufig die Telomere, die Centromere und die hochrepetitiven Bereiche mit den Genen für die ribosomalen RNA Gene.

Pseudogene sind genomische DNA-Sequenzen, die eine grosse Ähnlichkeit (80-90 Prozent) mit Sequenzen von Genen haben, aber ihre biologische Funktion verloren haben!
--> davon gibt es sehr viele

Einfache Sequenzwiederholungen
Mikrosatelliten  z.B. (CA)_n --> Wiederholungseinheit 2 – 7 bp
im ganzen Genom
wichtig für Abstammungskontrolle / genetische Kartierung
Minisatelliten --> Wiederholungseinheit 20 – 100 bp
im ganzen Genom
Abstammungskontrolle über Fingerprint
Satelliten --> Wiederholungseinheit einige kb
kommt nur im Bereich der Zentromeren vor

Retroposons und Transposons:
SINE (short interspersed nucleotide element)
  Retroposon, von zellulärer RNA abgeleitet
  z.B. Alu-Sequenz (Mensch), ca. 300 bp, abgeleitet von 7SL RNA
  ca. 1 Million Kopien im Genom
  SINE-Sequenzen sind speziesspezifisch ! (Mensch: Alu, Schwein: PRE, Maus: B1, ...)
LINE (long interspersed nucleotide element)
  Retroposon, von Retrovirus abgeleitet ?
  z.B. L1, ca. 6 500 bp, enthält mehrere ORFs
  ca. 500 000 Kopien im Genom

Typ I Marker:   (--> stehen in Zusammenhang mit Genen)
Gene, codierende Sequenzen
* zwischen verschiedenen Spezies konserviert, nicht polymorph, geeignet für physikalische Kartierung
Typ II Marker:   (--> viel grösser in ihrer Variabilität --> haben nichts mit Codierung zu tun)
polymorphe Stellen im Genom
z.B. SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, Spezialfall eines SNP)
Mikrosatellit (= STR, short tandem repeat = SSR, simple sequence repeat)
* normalerweise nicht konserviert zwischen verschiedenen Spezies, polymorph, daher geeignet für genetische Kartierung und Kopplungsanalyse

Bauplan ---> Gene (DNA)
wird von Generation zu Generation weitergegeben
Umwelt
die Interaktionen der Gene mit der Umwelt bestimmen das Ergebnis
Gebäude ---> Proteine
Individuum (sterblich)

DNA (Genom) ---TRANSKRIPTION--> RNA (Transkriptom) ---TRANSLATION--> Protein (Proteom)
 

Das auf F.Crick zurückgehende Prinzip für den gerichteten Informationsfluss der genetischen Information vom Träger der Erbinformation DNA über RNA als Vermittler hin zum Protein, welche durch Transkription und Translation erfolgt.

DNA (genetischer Informationsspeicher) ---> RNA (Arbeitskopien) --->  Proteine (Umsetzung)
(• Strukturproteine • Enzyme • Regulatoren der Gene)
1 Gen ---------------------------------------------------------------------------> 1 Protein                     

Der Informationsfluss geht von DNA über RNA zum Protein.

DNA-Sequenz:           CCC CAC CAG TAA           (--> Basentripletts)
mRNA-Sequenz:         CCC CAC CAG UAA
Aminosäure-Sequenz: Pro  His  Gln  STOP

* Information erscheint nicht direkt in den Proteinen!
* Wichtige Rolle bei folgenden biologischen Prozessen oder Erkrankungen:
  Entwicklung, Altern, Krebs, Diabetes, Schizophrenie, Psychosen

Es gibt im menschlichen Genom ca. 25‘000 Gene, die für Proteine kodieren.

Alternatives Spleissen von RNAs: ermöglicht Bildung von über 500‘000 unterschiedlichen Proteinen.

Spleißen: Bez. für das Herausschneiden von Introns aus der hnRNA (Primärtranskript), sodass für die Translation geeignete messenger-RNAs entstehen.

• Lyse (Auflösung) der Zelle
• Zellextrakt in Zentrifuge geben
• Sediment (Zelltrümmer) mit Proteinkinase K mischen
• Inkubation
• Mischen mit Phenol
• Zentrifugieren
  --> Phasenauftrennung: wässrige Phase (DNA&RNA) zuoberst, Interphase (denaturierte Proteine), Organische Phase (Phenol)
• Überstand in neues Gefäss überführen
• entweder a:
  • Überschichten mit Ethanol
  • 2 Phasen: oben Ethanol, unten konzetrierte DNA-Lösung
  • rühren mit Glasstab
  --> Ausgefällte DNA um den Glasstab
• oder b:
  • Mischen mit Ethanol
  • Zentrifugieren
  --> 2 Phasen: oben Ethanol, unten ausgefällte & sedimentierte DNA

• Mit dieser Methode werden simultan nukleäre und mitochondriale DNA isoliert!

Die Standardmethode DNA-Bruchstücke zu trennen, zu identifizieren und zu reinigen ist die Gelelektrophorese mit Agarose-Gelen. Die Trennung erfolgt nach Ladung und Grösse. Die Position der DNA im Gel kann direkt bestimmt werden. Dazu werden Banden der DNA mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Ethidium-Bromid angefärbt. Auf diese Weise können kleinste Mengen im Bereich von 5 ng DNA mit Hilfe von UV-Licht nachgewiesen werden. Der Farbstoff lagert sich zwischen die Basen und absorbiert bei 300 bzw. 360 nm UV-Licht oder übernimmt von der DNA absorbierte Energie von 260 nm und strahlt sie bei 590 nm im rot-orangen Bereich ab.

Benötigte Materialien:
* template DNA
* 2 Primer (je 18 – 25 Nucleotide lang)
* dNTPs (Desoxyribonucleotidtriphosphate)
* Taq DNA-Polymerase
* Reaktionspuffer
PCR-Programm:
5 min      94 °C
45 sec    94 °C
45 sec ~ 55 °C      ---> letzte drei: 25 – 40 Zyklen
45 sec    72 °C

 

* Die DNA ist der stoffliche Träger der Erbinformation.
* Durch die Abfolge der Basenpaare ist die genetische Information verschlüsselt.

Vorteile der sexuellen Vermehrung:
• Durch die Durchmischung des genetischen Materials (während der Bildung von Eizellen und Spermien unterscheiden sich Nachkommen in nicht voraussagbarer Weise von ihren Eltern! (genetische Variabilität)
• Dies kann einer Art helfen, in neuen verändernderten Umwelten zu überleben.

Vorteile der vegetativen Vermehrung:
• rasche Besiedelung günstiger Biotope
• keine Partnersuche
• keine Synchronisation der Geschlechtszyklen
• keine Ausbildung (oft komplizierter) Geschlechtsapparate

Adultes Individuum (m: 2n = 78, XY    w: 2n = 78,XX)
 Meiose ---> Bildung der Gameten
mtDNA (m: Spermium 1n=39,X oder 39,Y    w: Eizelle 1n=39,X)
Befruchtung
mtDNA Zygote (2n=78,XX oder 78,XY)
 Mitosen

S-Phase: DNA-Synthese & Histon-Synthese
G2-Phase: Wachstum & Vorbereitung für Zellteilung
M-Phase: Mitose   (--> ein sehr kurzer Zeitabschnitt verglichen mit dem restlichen Zyklus)
G1-Phase: Zellwachstum und Vorbereitung für DNA-Synthese
evtl. G0-Phase: Nicht-teilende Zellen

Weitergabe des Erbmaterials an die Tochterzellen --> alle haben den identischen DNA-Gehalt wie ihre Mutterzelle

Zwei genetisch identische Tochterzellen ---> Mutterzelle 2n = 8 ergibt 2x Tochterzellen 2n = 8

• 1. Schritt: Replikation der DNA (und Synthese Histon-Proteine)
• 2. Schritt: G2-Phase
   Wachstum und Vorbereitung für Zellteilung.
• 3. Schritt: Prophase der Mitose
   2 parallele Prozesse laufen ab:
   * Aufbau des Spindelapparates
   * Verdichtung des Chromatins zu Chromosomen
• 4. Schritt: Metaphase der Mitose
   Spindelapparat ist voll ausgebildet
   Verdichtung des Chromatins zu Chromosomen maximal
   Chromosomen in Aequatorebene
• 5. Schritt: Anaphase der Mitose
   Trennung der Chromatiden
   Bewegung der Chromatiden zu den entgegengesetzten Zellpolen
• 6. Schritt: Telophase der Mitose
   Abbau Spindelapparat
   Wiederaufbau Kernmembran
   Dekondensierung der Chromosomen