Ergänzende Molekularbiologie

Trans-Spleissen

• Verbinden von Exonen aus unterschiedlichen RNAs (können von selben Gen stammen)
• Mechanismus:
  • Leader überträgt sein pGpUp (=Intron?) auf ApGp (=Intron?) der pre-mRNA
    5'2'-Bdg verbinden die übertragene Gruppe mit pre-mRNA
  • die nun Verbundenen Gruppen (sind Introne) werden abgespalten und durch Leader ersetzt

Cis-Spleissen

• Verbinden von Exonen auf gleichen mRNA
• Mechanismus
  • Intron macht NU-Angriff auf sich selber und bildet dadurch Lasso, das ausgeschnitten wird, wodruch sich benachbarte Exone verbinden können
  • Wichtig:
    • Cis-Spleissen benötigt Proteine: U₁, U₂, U₄, U₅, U₆ (=snRNA)
      • diese werden in einem Zyklus in Zellkern ständig rezykliert
      • Lasso-Verschluss (Verknüpfen des freien Endes) sowie Verbinden Exonen ist ATP-abhängig 
    • RNA kann jedoch auch katalytisch aktiv sein und ohne Proteine cis-spleissen

Cis und Transspleissen können gleichzeitig auf gleichem pre-mRNA-Moelkül erfolgen. Sie dienen dem Entfernen der Introne. Danach muss mittels Polyadenylierung das 3' fixiert werden. Es entstehen mehrere mRNA-Fragmente, die nicht miteinander verbunden sind.

• müssen klein und präzis sein
• Lokalisation
  • zwischen intron-Exon
  • im Intron
    • U2: erkennt Verzweigungstellen
  • im Exon
    • ESE: Bindestelle für SR-Proteine

Krankheiten bedingt durch alternatives Spleissen: Spliceopathien

Wenn Bereiche, die für Spleissen wichtig sind (zB UTR) mutieren, läuft alt. Spleissen falsch ab und es entstehen funktionslose oder pathogene Proteine.

Beispiel: Myotone Dystrophie Typ I
3'UTR betroffen, wobei der Fehler auf RNA zurückzuführen ist (Dadurch wird Prot in folge abnormal, aber Quelle des Problems liegt im Spleissen der RNA)

mRNA Export aus Zellkern

• ist regulierbar, hat dadurch Einfluss auf RNA-Aktivität
• srProteine
  • Transportieren Histon-RNA (ungespleisst) sowie normale mRNA
• Aly-Protein
  • Erfüllt Doppelfunktion: für Spleissen und Export wichtig. Fördert Export
  • nicht an pre-mRNA gebunden, bindet erst nach Spleissen an Introne und bildet RNP (Komplex)  

Restriktionsenzyme sind Enzyme, die Bakterium vor fremder DNA schützt:

• Eigene DNA spezifisch Methyliert
• DNA mit ungewöhnlicher Methylierung wird von Restriktionsezymen geschnitten
  --> Kann genutzt werden um DNA an gewünschter Stelle zu schneiden

verschiedene Typen, davon für Klonieren nur jene brauchbar, die kleine Fragmente schneiden

• TypI
  • schneiden zufällig und benötigen ATP
  • Beispiel: SmaI erkennt CCCGGG/GGGCCC schneidet blunt ends an C/G Grenze
• Typ II
  • II: erkennen Palindrome und schneiden 4-8 bp lange Sequenz
  • IIS: erkennen und schneiden asymmetrische Sequenzen, ca. 20bp
  • benötigen kein ATP

Klonen mit Restriktionsenzymen

• Entstehen Enden
  • entweder blunt ends oder sticky ends: sticky mit 3' oder 5' overhang
  • 3' Hydroxyl- (OH) und 5' Phosphatgruppe
  • werden verschiedene Enden (sticky oder blunt) ligiert, entstehen neue Sequenzen, die nicht mehr vom ursprünglichen REnzym erkannt werden.
• Zu Beachten: DNA Adenin Methylse
  • Adenin in GATC wird in unter Einfluss von Dam methyliert, Cytosin in CCAGG oder CCTGG
  • Einige REnzyme werden duch diese Methylierung wirkungslos, andere wirken nur wenn dies der Fall ist

1. DNA aus Organismus isolieren (zB Insulinsequenz aus Mensch)
2. Mit Restriktionsenzym schneiden
3. Klonierungsvektor schneiden und DNA-Fragment ligieren
   • Plasmid: extrachromosomale cDNA
   • Aufbau
     • Origin of Replication: Startpunkt der Replikation
     • selektierbarer Marker: Antibiotikaresistenz
     • multiple cloning site (=Polylinker): dient Enbau von neuen DNA-Fragmenten, da der POlylinker selber mehrere Seqeunzen enthält, die von REnzymen erkannt werden.
4. künstliches Plasmid in Bakterium einschleusen
   • Bakterium
     • Ohne eigenes Restriktionsenzyme
     • Ohne Rekombination
     • Möglichst keine Exonucleasen
     • Auswahl durch Selektionsdruck: Antibiotikaresistenz mit DNA-Fragment eingeschleust

Isolation mRNA

• reife mRNA hat Poly-A-Schwanz, der dank Komplementarität an Poly-T bindet --> Binden, Auswaschen

Rückschreiben mRNA in cDNA

• entsteht Expressionsbibliothek: Introne und Promotersequenzen fehlen
• Vorgehen vgl Bild

• Sequenzbestimmung
  • Resktriktionsenzyme generieren Fragmente
  • Aus Fragmentgrössen Lage der Gene ersichtlich
  • Southern blot: dient Überprüfung
    1. DNA + REnzyme, danach Spalten der DNA --> einzelsträngige Fragmente
    2. Gelektrophorese
    3. Übertragen auf Membran (Nylon, Cellulose) durch Sogwirkung
    4. Sonde: RNA mit komplementärer Sequenz zur gesuchten Sequenz wird auf Membran aufgetragen
       --> Verbinden sich, werden beim Auswaschen erhalten und dadurch extrahiert. Wenn Extraktion erfolgreich, enthielt ursprüngliche DNA die Sequenz.
• Identifizierung von Mutanten
  • Fehlende/Veränderte Seqeunz wird von Restriktionsenzymen anders oder ganr nicht geschnitten
  • andere Muster nach Gelelektrophorese
• Produktion von Rekombinanten Proteinen
  • Insulin, EPO etc.
  • GST-Fusion
• Funktionelle Analyse von Genen und assoziierten Proteinen

Durch GST-Fusion Prozess

Designen

• pGEX: Plasmid, das für GST codiert. GST muss zusammen mit Protein of interest verbunden sein, damit dieses extrahiert werden kann
• Einfügen der gewünschten Sequenz darf Leseraster von pGEX nicht verschieben: MCS muss adaptiert werden
• Primer: werden designt, dann gekauft
  • Forward Primer: synthetisiert 5'3'-Richtung, ist komplementär zu unterem Strang (heisst, man kann einfach die Sequenz ablesen und bestellen. Es sei denn man will Schnittstellen für REnzyme)
  • Reverse Primer: synthetisiert in 3'5'-Richtung, ist komplementär zum oberen Strang
  • REnzyme: Primersequenzen können am komplementären Strang abgelesen werden. Wenn jedoch Schnittstellen eingebaut werden sollen, muss
    • mit sticky ends operiert werden
    • Die Sequenz am sticky end so verändern, dass von REnzyme erkannt wird

Vorgehen

• Sobald codierender Abschnitt mit F und R Primer ergänzt und wieder ligiert wurde, kann rekombinierte DNA erzeugt und mit REnzyme geschnitten (war schliesslich Ziel des Primerdesigning) und als Fragment in pGEX eingefügt werden.

Extrahieren

• rekombinante Proteine bindet über GST an Gluthation. DIeses Glutathion hafter wiederum an Oberfläche von Kügelchen

1. Prot und Küglenchen werden binden: Eluieren restlicher Proteine möglich
2. Zugabe von Gluthation: löst die GST-Bdg, Eluieren des Prot-of-interest möglich

Semikonservative replikation: neue DNA besteht aus einem parentalen Strang (=template Strang) und einem synthetisierten Strang

Substrate

• Primer
• Nukleotidtriphosphat. Bei Einbauen wird PPi aubgespalten, dieses dient E-Quelle für DNA-Synthese

Enzyme

• DNA-polymerase
• DNA-helicase
• Primase
• SSB
• Sliding clamp

5'3'-Richtung!

Funktion:

• DNA-Synthese und Reparatur
• Fehler-Korrektur

Aufbau

• aktives Zentrum
  • Verknüpfung weiterer Neukleotide nur möglich, wenn diese korrekt mit Template paaren 
  • Verknüpfung RNA-bausteinen (rNTP) nicht möglich: diskriminator-AS hindert Ribose (weil OH-Gruppe) in DNA eingebaut zu werden
  • zwei Mg²⁺-Ionen
    • 1) verienfacht Nu-Attack, indem es interaktion zwischen 3' ende des synth. Stranges und des einzubauenden nukleotids minimiert
    • 2) fängt negative Ladung der triphosphate ab, um Zugang des dNTP in DNA-polym. zu erleichtern
• Fingerdomäne:
  • verhindern interkation zwischen einzelsträngigem template Strang und aktivem Zentrum
• Exonuklease-site
  • falsch gepaarte Nukleotide werden zwar eingebaut, aber
    • die Syntheserate nimmt dadurch schnell ab
    • der synthetisierte Strang weist am 3'-OH Ende eine veränderte Affinität auf
      • normaler Strang: Affinität für aktive-site höher
      • misspaired-Strang: Affinität_exonuclease > Affinität_active-site

Chemotherapeutische Substanzen

• 5-fluorouracil & 6-mercatopurin: hemmung der Nukleotidsynthese, dadurch indirekte hemmung der DNA-Synthese (DNA-Polymerase hat keine Bausteine)
• cytosine arabinoside: Ausnutzen der diskriminator-AS-Eigenschaft --> nukleotiden wird OH-Gruppe angefügt --> dNTP werden zu rNTP
• cisplatin: reagiert mit G und verhindert dadurch trennen der Einzelstränge
• AZT (Azydothymidin) & Acyclovir: blockieren reverse Transkriptasen (AIDS Behanldung)

Leading strand

• Durchgehende 5'3'-Synthese
  • braucht einen primer

Lagging strand

• Fragmentierte 5'3'-Synthese: Okazaki-Fragmente
  • braucht mehrere primer --> Wichtigkeit von Primasen
• Geht gegen Overallrichtung der Synthese

Enzyme

• Helicasen
  • entwinden Doppelstrang unter ATP-Verbrauch
    • Experiment dazu: Denaturierung DNA nur möglich, wenn
      • Hitze
      • Helicase + ATP
  • binden an Einzelstrang
  • sind Polar: in 5'3' oder 3'5'-Richtung arbeitend
  • hohe Diversität: Funktion immer Entwinden, jedoch unterschiedliche Helicasen für DNA-Reparatur/Replikation/Rekombination etc.
• Primasen: 5'3'-Richtung
  • können überall auf template beginnen, komplem. Nukleotide aneinanderzuketten --> bilden so primer
  • synthetisieren hingegen RNA (nicht DNA)
  • Primer am lagging-strand
    •   werden entfernt, sobald Primer von DNA umgeben ist
      1. RNase H entfernt nur RNA aus RNA-DNA-Hybrid (5'-ende Nukleotid bleibt erhalten)
      2. 5'-Ende RNA-Nukleotid wird durch Exonuclease entfernt. Hier entseht später auch nick
      3. DNA-Polymerase erkennt primer-template junction und füllt diese 5'3' aus, entsteht jedoch nick (weil DNA-Polym. nicht 3'5' binden kann?)
      4. DNA ligase verbindet neu synth DNA mit Okazakifragment auf 3' Seite
• SSB: Einzelstrang Bindeproteine
  • Wichtig für Replikation --> Mutation SSB ist lethal
    • Verhindern frühzeitige Hybridisierung beider Einzelstränge
    • Begünstigen Binden von Primern an DNA
  • Kooperativer Effekt: je mehr SSB an einem einzelstrang, desto mehr neue SSB binden zusätzlich an diesen.
• DNA-Topoisomerasen
  • DNA-Torsionsstress minimieren
  • Typen
    • I: ohne ATP
    • II: ATP-Verbrauch zu KOnformationsänderung (nicht zur Spaltung der DNA)

DNA-Polymerase-switching: Existieren verschiedene DNA-Polymerasen für untershciedliche Funktionen

• Switching: nicht effiziente DNA wird durch effizientere Ersetzt
  • Effizienz auf sliding-clamps zurückzuführen
    • DNA + Polymerase immer in Nähe voneinander
    • Entgleisen Polymerase kann dank sliding clamp rasch rückgängig gemacht werden
• Sliding clamp
  • keinen direkten Kontakt zu DNA
  • erhöht Prozessivität DNA-Polymerase --> fällt weniger schnell ab (aber verknüpft weiterhin ein Nukleotid nach dem anderen, sonst proofreading unmöglich)
  • Verbleibt an neu synth Doppelstrang nachdem Polymerase entfernt wird. Dient vermutlich als Singnal für weitere Enzyme

Aufbau

• 1 Ringklemme, mehrere Polymerase Enzyme. Ringklemme wird auf clamp loader gelanden, Polymersen an tau-Proteinen fixiert
  --> vgl. Bild

Machnismus des Replisoms

• Anbringen von clamp passiert über clamp-loader:
  • loader nimmt ATP auf, ohne dieses zu spalten
  • anbringen der noch offnen clamp an dsDNA
  • ATP-Hydrolyse: clamp wird verschlossen, loader entfernt sich
• koordinierte Replikation
  • Helicase bindet an lagging strand, arbeitet 5'3' (=Overall)
    • Tempo wird bei Trennung von tau-Prot gebremst, damit keine Lücke zwischen Helicase und Holoenzym entsteht
  • SSB-Prot auf beiden Einzelsträngen
  • Leading-strand
    • Polymerase mit slinding clamp kann unkompliziert replizieren
  • Lagging-strand: läuft in Gegenrichtung des leading-strand (aber auch 5'3' --> Ringklemme Indiz für Richtung, da diese immer hinter Polymerase steht).
    1. Primer werden gleich nach Helicase gesetzt
    2. Polymerase ohne Ringklemme nachdem Okazaki fertig --> neue Ringklemme durch loader an neusten Primer gesetzt (lagging strand braucht mehrere clamps!)
    3. Synthese komplementären Stranges, wobei Schlaufe grösser wird. Synthese abgebrochen, sobald Pol. Doppelstrang-Ende des letzten Okazakifragmentes erreicht hat
  • bei Eukyronten
    • DNA-Polym. eta für leading, alpha (primer) und delta für lagging-strand
    • Ringklemme: beta-Ring
    • keine clamp-loader & tau units?

Initiation

• Initiator-Prot: für Denaturierung, Protein-rektrutierung wichtig

1. DnaA (Initiator) erkennt initiator-DNA-binding site (9mer) und bindet an diesen
2. bewirkt Denaturierung benachbarter, A/T-reicher Seqeunzen (13mer, lassen sich leicht voneinander lösen)
3. Ansetzen von Helicase (DnaB) durch Loader (DnaC)
4. Primase kann Primer setzen, Replikation beginnt:
5. ein Holoenzym setzt pro Einzelstrang an

Dienen in prokaryoten schnellerem Wachstum: Bei Zellverdopplung werden Plasmide mit bereits angefangener Replikation weitergegeben, um Zeit zu gewinnen

• Erste Replikation vollständig --> 2 Plasmide aus Mutterplasmid
• zweite Replikation durch Hemimethylierung eingefroren
  • GATC-Sequenz immer methyliert, ausser wenn frisch repliziert (also am Tochter-Einzelstrang) --> hier Hemimethyliert: template ja, kompl. synthetis. Strang nicht. Solange Hemimethyliert, keine neue Replikation möglich, wobei diese aber auch nicht zu früh starten soll (wieso?)
  • SeqA: bindet an template und blockiert temporär Binden von DAM-Methylase sowie DnaA, die Methylierung vervollständigen

ORIs

• in Prok. nur 1
  • bidirekational
• in Euk.
  • mehrere, sehr viele
    • Replikation dadruch schneller
    • Replikation muss unbedingt vollständig ablaufen. unreplizierte DNA wird in Anaphase brechen.
    • können aktiviert werden, aber auch passiv repliziert werden (füllen dadurch ihre Funktion nicht aus)
      • je nachdem, zu welchem zeitpunkt die Replikation startet
  • bidirektional

Ziel: Trennen der Stränge um Replikationsblase zu bilden

• als erstes muss Helicase angebracht werden
  • nur in G1 Phase, in anderen absichtlich inhibiert
  • zwei Kopien von Mcm2-7 Helicase werden über ORC (origin of replication complex) und Hilfsproteine an dsDNA montiert
  • Verbrauch 2 ATP
    • eines für Cdc6 Aufnahme an ORC
    • andere damit ORC sich von helicasen und DNA lösen kann
• Aktivierung der Mcm2-7 Helicasen: Startschuss für Zusammenbau des Replisoms
  • Nur in S, G2 und M-Phase
  • Die Kinasen CDK und DDK binden zusammen mit weiteren Proteinen an Mcm2-7 Helicasen --> CMG-komplex
  • Der CMG-Komplex kann geöffnet werden, wenn GINS und Cdc45 agieren --> Denaturierung DNA
  • Polymerase alpha und delta können nun von aussen eindringen (aplha typischerweise an lagging strand, delta an leading strand)

Histon Vererbung (Epigenetik)

DNA ist über H3/H4 entweder methyliert oder acetyliert. Dadurch wird Zustand (zB "wird repliziert") der DNA beschrieben. Dieser muss auch nach Replikation beschrieben werden können, deswegen nötig, H3/H4 neu zu generien und zu codieren.

Vererbung

• Braucht nach Replikation doppelt so viele Histone wie davor --> Teil davon wird neu gebildet
• Histon-Pool: bei Replikation werden Histone von DNA getrennt und gehen in diesen über
  • H3-H4 Tetramere werden zufällig in template oder neue DNA eingefügt, ohne in den pool einzugehen
  • neue H3-H4 Tetramere werden ebenfalls gebildet und sofort eingefügt --> bilden Grundlage der neuen Histone
  • H2A und B binden an H3-H4 Tetramere, wobei neusynthetisierte und alte H2A/B-Moleküle zueinander in Konkurrenz stehen.
  • Nach Bilden der neuen Histone unterlaufen diese durch HAT epigenetische Modifizierungen

Enzyme

• HAT (Histone acetyltransferase): Acetylierung von Histon-Aminoschwänzen --> uncoiling der DNA: Transkription möglich
• HDAC: Deacetylierung --> Kondensierung der DNA
• Chromatin assembly factors: transportieren Histon bestandteile zur frisch replizierten Strängen
  • CAF-I: transportiert H3-4 Tetramer, wird über sliding clamps bewegt
  • NAP-I: H2A-H2B Dimer

Problem: auf lagging-strand kann irgendwann kein Primer mehr gesetzt werden, weil die Sequenz, die Primase erkennen sollte, zu kurz ist (=kann nicht erkannt werden). Es wird kein Primer gesetzt --> DNA-Polymerase stoppt vor Ende des Chromosoms.

• Es entsteht ein 3' overhang des template Stranges gegenüber dem lagging strand, dessen 5' ende zu kurz ist.
• Folge: bei nächten Replikation wird der kürzere, neu synth. Strang als template dienen und nochmals eine kürzere Tochter-DNA generieren --> DNA wird immer kürzer

Lösung

• Prokaryoten: Protein-priming --> Primer ausserhalb der eigentlichen DNA-Sequenz
  • Protein mit einer OH-Gruppe, an die DNA-Polymerase andocken kann, der ebenfalls an 3'-Ende (und 5'Ende?) binden kann. Dadurch erfolgt vollständige DNA-Replikation.
• Eukaryoten: Telomerase --> Verlängerung, aber kein Entfernen des 3' Overhangs
  • telomerische DNA (sher viele kleine, repetitive Sequenzen) wird ausgehend von RNA synthetisiert --> Reverse-Transkritpase-Funktion der Telomerase!
  • Mechanismus
    1. Telomerase verlängert 3' Ende --> Primase kann wieder Primer setzen
       • Tut dies öfter als ein Mal: da Sequenzen repetitiv, erkennt Telomerase Enden immer wieder
    2. Neues Okazaki-Frag dank neuem Primer --> DNA-Polm. agiert.

1. Ja, wenn Regulierung Telomeraseaktivität falsch abläuft. zB Rap1 defekt.
   • Hefe
     • Rif1 und 2 binden über Rap1 an dsDNA, die alle Telomerase hindern, zu binden
     • Cdc13 an 3'-overhang, hilft Telomerase zu binden
   • Mensch:
     • Shelterin: Proteinkomplex (ähnlich wie bei Hefe, aber andere Proteine), der Telomerase hindert an dsDNA zu binden
   • Regulierung: Je mehr Inhibierende Komplexe vorhanden, desto länger das Telomer und desto weniger Telomerase nötig. Kurze Telomere inhibieren Telomerase weniger und werden dadurch im Endeffekt verlängert.
2. Nein,
   • die Telomerase kann nur ansetzen, wenn die Telomere zu kurz sind. Jedoch ist das nicht immer bei allen Telomeren der Fall --> die Länge variiert.
   • Zudem agiert Telomerase nur in gewissen Zellen (Stm.Zellen), und in anderen nicht: Zellen Darmmucosa. In letzteren nimmt länge telomere mit Zeit (Alter) ab.

Normale Zellen durchlaufen Apoptose nach einigen Zellteilungen, um Kummulierung von Gendefekten entgegenzuwirken. Dies wird durch Aktivierung von p53 gewähleistet.

• p53 inhibition: kürzere Telomere und mehr Zellteilungen, Telomerase inaktiv/abwesend --> Crisis
• zusätzlich Telomeraseaktivität --> HeLa-Zellen
  • unsterblich, weil keine Apoptose mehr durchlaufen (?)

Punktmutation: Korrektur durch zweite Replikation

• Doppelt genäht hält besser
  1. nach ersten Replikation können "bumps" (nichtpaarende Basen weiter voneinander entfernt als üblich) erkannt und durch 3'5'-Exonucleasen entfernt werden =Proofreading
     Fehlerquote vorhanden
  2. nach zweiten Replikation entsteht ein Strang, der mit Parentalem Strang identisch und einer, der Punktmutation übernommen hat, aber wenigstens mit paarenden Basen ausgestatett wurde.
     Fehlerquote weiterhin vorhanden, minimiert (≠0%) --> Mutationen fördern in richtigem Mass Evolution!

Prokaryoten

• Erkennen des Missmatches: DAM-Methylierung --> fehlerhafte Strang ist nicht methyliert
• Korrigieren des Missmatches: MutS bindet an dsDNA und macht proofreading
  • Mismatch erkannt --> Rekrutierung weiterer Proteine
    • unter ATP-Verbrauch
    • MutH, eine Endonuclease; schneidet neu synth. Strang vor dem Mismatch (macht nick)
    • Schnitt nur möglich, wenn in direktem Kontakt mit MutS --> entsteht loop (wenn MutS+H weit entfernt)
  • nick erkannt --> entfernen DNA von nick bis zu bump und damit des fehlerhaften Nukleotids
    • 3'5'-Exonucleasen oder 5'3'-Exonucleasen, je nach Ausrichtung von MutS und MutH
  • Pol-III: füllt Lücke, dieses mal richtige Basenpaarung

Eukaryoten

• leading strand: Fehler wird erkannt und gewisse Proteine rekrutieren Exo-I --> Ausschneide fehlerhaften Abschnittes und Umgebung --> DNA-Polymerase
• lagging strand: nicks vorhanden, fehlerhafte DNA einfach für Exonucleasen zugänglich.

Nukleotide können auf vielen Wegen (Hydrolyse, Oxidation, Alkylierung, Deamination) modofiziert werden. Gefählich sind Veränderungen, die in DNA natürlich vorkommende Basen erzeugen. Veränderungen, die fremde Basen erzeugen werden erkannt und sind weniger tükisch.

• Thymin-Dimer Bildung über UV-Strahlung
  • zwei Thymin-Basen verbinden sich zu Cyclobutandimer --> DNA wird unbrauchbar
  • Reparaturmechanismus: Photolyase
    Lyase löst Dimer unter Einwirkung von LIcht wieder auf. Bindet jedoch nur im Dunklen an diesen.
• Basenanaloge und Agenzien, die Nukleotidabstand verändern (=interkalierend)
  • Ethidium-Bromid: fixiert sich zw. Basen und macht dadurch nukleinsäurehaltige Bereiche unter UV gut sichtbar
  • 5-bromouracil: wird als Thymin missinterpretiert
• Methyltransferase: entfernt Methylgruppe aus methyliertem Guanin

MMR erkennt falsche Watson-Crick Basenpaarung

BER erkennt fehlerhafte Sequenzen, ohne dass diese gewölbt sind

NER erkennt Wölbung in DNA, häufig durch UV (Thymidindimer)

Defekte Base: base excision

• Defekte Base (= oxidiertes Guanin) kann aus DNA rausgeklappt und entfernt werden
• OxoG:A garantiert fehlerfreie Korrektur dank Glycosilase, zwei Interventionsstellen
  • vor Replikation: Base excision durch DNA-Glycosylase
  • nach Replikation: fail-safe Glycosylase erkennt oxoG und interpretiert es als normales G --> einbau eines korrekten C statt A und zurück zu "vor Replikation"

Defektes Nucleotid: nucleotide excision

• lokale DNA-Denaturierung mit folgenden Ausbau und Neusynthese durch DNAPolymerase
• UvrA/B/C/D
  • A&B: bilden tetramer, wovon nur B an Fehlersequenz verbleibt
  • ein B wird durch UvrC ersetzt --> Schnitt um Läsion
  • UvrD entfernt Fehlersequenz sowie UvrC
  • Loch wird gefüllt
• Uracil-Glykosylase: entfernt zuerst Uracil, danach mithilfe AP-Exonuclease das basenloose Nukleotid. Pol I füllt Loch wieder mit T statt U aus (Uracilglykosilase korrigiert fehlerhafte DNA, die noch mit rNTP aufgebaut ist)

Dienen Reparatur von Doppelstrangbrüchen, Mutationsrisiko dabei relativ hoch

Homologe Rekombination

• dient Schutz vor Doppelstrangbrüchen und Mutationen
• kann nur erfolgen, wenn zwei dsDNA vorhanden sind, die zudem sehr ähnlich (homolog) sind
• ähnelt CO, nur wird keine Erbinformation ausgetauscht sondern kopiert (template strang bleibt unverändert)
• Mechanismus
  • Holliday-Struktur

Nicht homologe Rekombination

• NHEJ: nicht homologes end-joining von dsDNA. "Nicht homolog" weil keine template verwendet wird, sondern einfach wieder zusammengeklebt
  • Mutationen vorprogrammiert, weil Verdau 1-2 Nukleotiden nötig, um Zusammenfügen zu ermöglichen
    • Artemis: Exonuclease funktion
    • Ku70&80 binden an Bruchenden
    • spezielle Ligase und Hilfsproteine
  • wird für Antikörper Designing verwendet, verantwortlich für grosse Vielfalt an Möglichen Antikörpern

Translesions-Synthese

• Doppelstrangbrüche können zwar repariert werden, dennoch vermeidet sie die Zelle stark: Der Translesionsmechanismus dient dem nicht-Abbrechen der DNA-Replikation, wenn dabei ein Fehler auftaucht. Der Fehler wird absichtlich toleriert, um Zelltod zu verhindern, in der Hoffnung, ihn später korrigieren zu können.
• Spezielle DNA-Polymerasen, Translesionspolymerasen, können spez. Fehler erkennen und werden diese mit bestimter Sequenz codieren, um später Korrektur vornehmen zu können.
  • gap-filling-modell
  • polymerase-swichting-modell

Holliday-junction:

Eigenschaften

• zwischen zwei Homologen möglich (Ausnahme Doppelstrangbruch?)
• χ-Site: Hotspot für hom Rekomb weil es RecBCD-Aktivität reguliert
• Mobil: Hollydayjunctions können wandern

Entstehung

• Stranginvasion
  • Einführen eines Doppelstrangbruches
    • Pro: benötigen hierfür keine Enzyme!
    • Euk: Spo11 (ähnlich Topoisomerase)
      • arbeitet mit MRX
  • Overhang-Bildung
    • Pro: RecBCD
      1. Helicaseaktivität: RecD schnell in 5' und RecB langsam in 3'-Richtung --> Schlaufenbildung, ATP-Verbrauch
      2. RecC erkennt Chi wenn Schlaufe verkürzt wird
         • --> Bau RecA initiiert (dieses steht mit SSB in Konkurrenz)
         • --> RecBCD-Komplex bleibt stehen
    • Euk: MRX-komplex arbeitet 5'3' und generiert dank seiner Exonuclease-Aktivität 3' overhangs
  • Pairing
    • Euk: Rad51 und Dcm (das nur in Meiose in Zelle vorkommt)
    • Pro: RecA
      • bindet an 3' overhangs (aus 5' kommend, arbeiten in 5'3')
        • streckt DNA durch Entspiralisierung --> vereinfacht Suche nach Homologen
        • RecA-Spirale besitzt im Inneren 3 Bestandteile, die effizient nach Homologien suchen können
        • besteht aus Filamenten (ähnlich SSB), wird kooperativ 5'3'  auf ssDNA aufgebaut
          • ssDNA+RecA verbleiben während Stranginvasion zusammen. Der unverdaute STrang paar mit dem RecA-beladenen Strang und bildet dadurch den Heteroduplex.
            • Heteroduplexe: pairing unvollständig, weil Homologe sich in einigen Nukleotiden unterscheiden können --> einige Basen paaren nicht

Auflösung

• nach Replikation
• Genaustausch unterschiedlich möglich, je nach Schnitt
  • Crossover products: alle Stränge verändert
  • Non-crossover-products: ein Strang bliebt unverändert, trotzem Sequenzen ausgetauscht
• Enzyme
  • Pro: RuvAB & RuvC
    • RuvAB-Komplex: erkennt junction und kann diese verschieben
      • RuvB: Helicasefunktion (ATP-Verbrauch): pumpt DNA durch sich selber (Donutförmig) während RuvA die junction innerhalb stabililsiert
    • RuvC: Schneidet H-junction
      • erkennt spez. Sequenz, sobald diese durch Migration der H-Junction in RuvAB-komplex gerät

Aufbau

• target site duplication
• inverted repeats
• transposase
• transposable element

DNA-Transposon (Klasse-II-Transposon): verwenden Transposasen

• konservatives Transposon: vermehrt sich nicht
  • Cut&Paste-Mechanismus
  • inverted repeats
    • ermöglichen self-pairing, da Transposase sticky-ends hinterlässt
  • target-site duplication
• replikatives Transposon: kopiert sich, Kopie besetzt neue Lage in DNA
  •  

RNA-Transposon (Klasse-I-Transposons): verwenden reverse Transkriptase

• Retroviral: mit long terminal repeats
• Nichtretroviral: Ohne LTR

Pseudogene: Abkömmlinge aktiver Gene, die durch Genduplikation, RT oder anderen Ursachen inaktiv wurden, sich aber weiterhin um Genom befinden.

Prozessierte Pseudogene (retro-pseudogen)

• Entstehung: durch Einfügen revers transkribierter mRNA
• "prozessiert" weil Transkription abgelaufen: Spleissen hat stattgefunden, danach zurück in Genom über RT eingebaut
  • Introne fehlen auf mRNA und desawegen auch auf prozessiertem Pseudogen
  • weisen poly-A auf --> mRNA hat keine interne Poly-A --> Indiz für Entstehung aus rev- transkribierter mRNA
  • nicht aktiv weil promotor fehlt
  • werden von inverted-repeats-ähnlichen Sequenzen flankiert

Dupliziertes Pseudogen

• bei Genduplikation durch inaktiviernde Mutation entstandenes Gen
• Beispiel: TOP1

Rekombinasen führen CSSR (conservative site-specific recombination) und Transposition aus: verlagern transposable elements der DNA, die sie über die recombination seites an deren Enden erkennen. Existieren mehrere Möglichkeiten, dabei bleibt das transposable element unverändert (deswegen "konservativ", trpsle-element wird nur an Enden geschnitten, um von DNA getrennt zu werden)

• auf derselben site des Chromosoms, nur Reihenfolge der transposable elements wird verändert
  • Insertion, deletion, inversion
  • ≠Transposition weil bei dieser transp.element chromosom wechselt
  • Konservativ
• Transposition (=translocation?) = integrative recombination, bei der transp.el. in nicht-spezifische DNA auf einem anderen DNA-Molekül insertiert wird
• Unterschied zu CO:
  • CO wird über homologe DNA-Sequenzen reguliert, SSR hingegen über Lage von Bindesequenzen für Rekombinasen
  • SSR verändert genepxression, wobei das bei CO nicht der Fall ist

Sinn & Nutzen

• Genmanipulierung und Bioengeneering
• Antigen-Expression --> Beispiel für die Variierung der genepxression durch SSR

vgl Mind-Map weisses Mäppchen

Mechanismus: Backbone wird gebrochen, Rekombinase bindet kovalent an DNA und bildet dadurch ein Protein-DNA-Kovalent. Nach Transport läuft Reaktion (Nu-Angriffe) rückwärts ab und DNA wird dadurch wieder verschweist (keine Ligase nötig). Serin- sowie Tyrosin-Kinasen verwenden diesen Mechanismus.

• Serin-Rekombinasen: 1 Serin-Rekombinase schneidet 1 DNA-molekül --> immer 4 davon nötig. Schnitt ist "sticky-end" mässig mit 2 BP overhang und erfolgt an sich überlagernden DNA-molekülen. Erfolgt alles auf einmal
  • Hin-Ser-Rekombinase: durch Inversion (Hin erkennt hix-recomb. sites) wird entweder H1 oder H2-flagellin Gen exprimiert --> schützt/versteckt Salmonellen vor fremden Immunsystemen
    • zusätzlich auch FIS (de pute) --> statt zweiförmiges wird dreiförmiges Segment gebildet, Rekombinationsrate wird 1000x grösser
• Tyrosin-Rekombinasen: Schneiden und verbinden zuerst zwei von vier DNA-Molekülen, danach restlichen zwei --> Vorsicht mit 5' & 3'- Enden: werden immer nur 5' + 3' bzw 3' + 5' verbunden. D.h. zuerst werden die beiden 5'3'-Moleküle verlinkt, danach die beiden 3'5'-Moleküle
  • λ-Bakteriophage: ds-DNA befällt Wirt-DNA und baut sich dank AttP & AttB ein. Zwei Zustände möglich
    • lytisches Wachstum: Synthese neuer Viren, Absterben Wirts
      • Lambda-Rekombinase inaktiv
    • Lysogene Vermehrung: Vermerhrung des Wirtes mit infizierter DNA
      • induziert durch Aktivität der lambda-Rekombinase + IHF: integration host-factor: verbindet Phagen und Wirt-DNA so, dass lambda-Rekombinase an beide binden kann
  • Phage P1-Cre: infiziert seinen Wirt mit einem Plasmid, das nicht in Wirt-DNA eingebaut wird. Für Vererbung dieses Plasmides ist es jedoch wichtig, das sich neue, vom Wirt synth. Plasmide von der Wirt-DNA trennen (bilden Dimer zwei ineinander verschlossener Ringe) --> Cre/lox-System
    • Cre: rekombinase (SSR, Tyr-Kinase!), die Plasmide trennt und wieder versiegelt
    • lox: recognition sites auf Wirt und Phagen-Plasmid

Grundgerüst

• aus rRNA aufgebaut, mit proteinen (UE) ergänzt
  • mRNA und tRNA bindene Stellen sind von Proteinen fast komplett frei
  • rRNA:
    • wird durch Spleissen im Nucleolus "gereift"
    • bestimmt Struktur der Ribosomen, da Proteine später an dieser anhaften
  • Proteine: rpS & rpL
    • stark basisch weil viel Lys & Arg --> dringen ins Innere des Ribosoms ein und sind mit der anionischen rRNA fest/stabil verbunden
    • bilden globuläre Domänen auf Ribosomenoberfläche
• Untereinheiten 70s Ribosom (Prokaryoten)
  • 30s
    • 21 Proteine & eine 16S rRNA
      • 16S RNA erkennt Shine-Dalgarno-Sequenz auf mRNA (dank der eigenen anti-Shine-Dalgarno-Sequenz) und kann damit mRNA binden.
    • einzelnen Bestandteile der 30S UE sind mobil --> wichtig für Transkription
    • Anticodon-Arm --> bindet mRNA
  • 50s
    • 31 proteine & 23S sowie 5S rRNA
    • Akzeptor Arm: nimmt tRNA auf (sicher?)
    • Polypeptidtunnel: Durchtrittstelle des synth. Proteins. Am Ausgang werden Prozessierung,Faltung und Lokalisation des naszierenden Proteins durch Faktoren beeinflusst/gegeben.
      • L4e und L22 bilden Engstelle und sind konservierte rib.Proteine
  • A,E und P-Stelle
    • werden durch Halbseiten der beiden Untereinheiten gebildet
      • A,P und E-Stelle befinden sich zwischen den UE
      • A,P und E-Stelle beschreiben nur Lokalisierung: Jede Stelle wird beim Wandern des Ribosomes einmal zur A, danach P, danach E und wieder zu A Stelle
        • Polpeptid ist immer auf P-Stelle
    • A: ankommende Aminoacyl-tRNA (=tRNA mit AS) wird aufgenommen
    • P: Proteinbildung durch übertragung der AS auf die naszierende Polypeptidkette, die zT im Tunnel steckt aber immer auf P-Stelle verbleibt

• Funktion: vgl. Bild
• Basics
  • bis zu 30% Zellmasse sind Ribosomen
  • Synthese sehr teuer, und dennoch werden/müssen viele Ribosomen synthetisiert werden:
    • rRNA und rp-RNA (ribosomale protein DNA) in ZK, machen 80% gesamten Transkription aus
    • Im Nucleolus: DNA-->pre-rRNA --> 30S rRNA + 50S rRNA
      • diese beiden rRNA gelangen aus Nucleolus in Nucleus und werden mit importierten rpL und rpS ergänzt, bevor sie ins Zytosol entlassen werden.