Biotech Zellkulturtechnik
Runde 2
Runde 2
Set of flashcards Details
| Flashcards | 24 |
|---|---|
| Language | Deutsch |
| Category | Technology |
| Level | University |
| Created / Updated | 08.09.2015 / 17.04.2017 |
| Weblink |
https://card2brain.ch/box/biotech_zellkulturtechnik
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| Embed |
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Benennen Sie drei industriell relevante Anwendungen für tierische und humane Zellen.
o virale Impfstoffe.
o monoklonale AK.
o neue Medikamente durch rekombinante Zellen.
o „tissue engineering“.
o Gentherapie.
Benennen Sie 5 charakteristische Eigenschaften tierischer Zellen.
o niedrige Wachstumsraten (Verdopplungs-t 15–25 h).
o hohe Absterberaten (Apoptose).
o geringe Zelldichten (in Standardmedium ca. 2–3∙106 Zellen mL-1 im batch).
o niedrige Produktivitäten (Hybridoma ca. 10–100 mg L-1 AK im batch).
o tlw. adhärent (Wachstumsoberfläche erforderlich).
o komplexe Medienanforderungen (tlw. Serumzusatz erforderlich).
o hohe Scherempfindlichkeit (da nur Zellmembran).
Benennen Sie 3 häufig eingesetzte permanente Zelllinien und jeweils eine mögliche Anwendung.
o BHK-21: adhärente Zellen, können an Suspension adaptiert werden, Impfstoffe gegen Maul- und Klauenseuche oder Tollwut, rekombinante Wirkstoffe (Faktor VIII).
o CHO-K1: adhärente Zellen, können an Suspension adaptiert werden, rekombinante Wirkstoffe (HBstg, tPA, Faktor VIII).
o MDCK: Veterinärimpfstoff, Influenzaimpfstoff.
o 3T3: Zellkulturtechnik.
o WI-38: Impfstoffproduktion.
o Vero: Impfstoffproduktion.
o HeLa.
Benennen Sie 5 Anforderungen an Bioreaktoren für Zellkulturen.
o T-Kontrolle.
o pH-Kontrolle.
o Versorgung mit O2.
o Versorgung mit Nährstoffen.
o scherstressarme, homogene Durchmischung.
o keine Stofftransportlimitierungen.
o ausreichend Oberfläche für adhärent wachsende Zellen.
o sterile Bedingungen.
o vielseitige Verwendbarkeit (Zelllinien, Produktentwicklung, etc.).
o Scale-up-Fähigkeit.
Was versteht man unter “microcarrier” und für welche Zelltypen werden Sie in welchen Reaktorsystemen normalerweise eingesetzt?
o Ein „Microcarrier“ ist eine unterstützende Matrix für das Wachstum adhärenter Zellen in Bioreaktoren. Microcarriers sind Kugeln, die typischerweise einen Durchmesser von 100–300 μm aufweisen und können durch das Material aus dem sie bestehen, neben Oberflächenchemikalien (z. B. ECM-Proteine, rekombinante Proteine, Peptide, geladene Moleküle), das Zellverhalten (u. A. Morphologie und Proliferation) beeinflussen. Diese werden vor allem für Protein-produzierende oder Virus-generierende, adhärente Zellpopulationen in großem, industriellem Maßstab zur Produktion von Proteinen und Impfstoffen verwendet. Die Vorteile bestehen in der Scale-up-Fähigkeit, der Möglichkeit in Computer-gesteuerten Bioreaktoren präzise die Bedingungen des Zellwachstums zu kontrollieren, der Reduzierung des benötigten Raums für Maschinen und der deutlichen Verringerung des Arbeitsaufwands.
Für Festbett- oder Wirbelschichtreaktoren stehen Ihnen makroporöse Trägermaterialien mit Durchmessern von 1 mm und 3 mm zur Verfügung. In welchem erwarten Sie die höhere Zelldichte? Begründung!
o Die Zelldichte ist reziprok proportional zum Durchmesser der Trägermaterialien. Die höhere Zelldichte ist bei einem Durchmesser 1 mm zu erwarten. Dies liegt in der sich proportional verhaltenden Stofftransportlimiterung begründet.
Welcher Effekt ist bei der Zellschädigung durch Blasenbegasung der wichtigste?
o Schaumbildung.
Welche Kriterien für den Betrieb von gerührten und begasten Reaktoren sollten beachtet werden, um das Risiko einer Schädigung durch Rühren und/oder Blasenbegasung gering zu halten?
o Der Rührer sollte einzig zum Suspendieren der Zellen oder Microcarrier dienen, das Medium schonend mischen und dabei nur wenig Energie eintragen. Damit sollte die Zellschädigung nur noch von der Blasenbegasung ausgehen.
o In gerührten Reaktoren sollte der Energieeintrag < 1000 W m-3 sein.
o Die Rührerumfangs-v sollte bei 1–2 m s-1 liegen.
o Für Air-Lift-Reaktoren und Blasensäulen sollte das Verhältnis von Höhe zu Durchmesser bei kleinen Reaktoren ~14, bei großen 6–7 sein.
o Die Begasungsrate sollte so gering wie möglich sein (bei Blasenbegasung < 0,1 vvm).
o geeignete Additive wie Pluronic®-F68 sollten, wenn mögl., zugegeben werden.
Welche Typen von Membranen können für die blasenfreie Begasung von Suspensionsreaktoren verwendet werden? Benennen Sie zwei Varianten für die technische Umsetzung der blasenfreien Begasung in Bioreaktoren.
o Poröse Membranen.
Varianten
Schlauch (radial, statisch)
Schlauch (axial, rotierend)
Schlauch (axial, taumelnd)
o Diffusionsmembranen.
Varianten
Armierte Silikonmembranen
Benennen Sie zwei Begasertypen für die Blasenbegasung. Sie müssen zur Versorgung der Zellen einen kLa-Wert von ca. 10 1/h erreichen. Welcher Begasertyp kommt hierfür in Frage?
o Mikrosparger (kLa > 10 h-1).
o Begasungsrohr.
o Ringbegaser.
o Begasungsplatte.
o Begasungsfritte.
Zur Begasung von Suspensionsreaktoren haben Sie die Wahl zwischen Blasenbegasung und blasenfeier Begasung mittels Membranen. Nennen Sie jeweils einen Vor- und Nachteil für jede Methode. Welche Begasungsart würden Sie für industriell eingesetzte Reaktoren (> 1000L) vorschlagen? Warum?
o Blasenbegasung
Vorteil: geringerer Installations- und Wartungsaufwand.
Nachteil: evtl. Zellschädigung.
o blasenfreie Begasung
Vorteil: geringe Zellschädigung.
Nachteil: hoher Installations- und Wartungsaufwand.
o Begasungsrohr, da es am besten zu reinigen und zu sterilisieren ist. (GMP schwierig bei den eigentlich besseren Begasungsfritten und -ringen.)
Skizzieren Sie schematisch einen in Perfusion betriebenen Suspensionsreaktor. Benennen Sie 3 Techniken, die zur Zellrückhaltung in Suspensionsreaktoren eingesetzt werden können.
o Mikro- oder Ultrafiltration (intern oder extern).
o Spin-Filter (intern oder extern).
o Settler (intern oder extern).
o Zentrifuge (extern).
o akustischer Filter (intern).
o Dialyse (intern oder extern).
Benennen Sie drei Vorteile und drei Nachteile von Suspensionsreaktoren für die Kultivierung tierischer Zellen.
o Vorteile
konventionelle Reaktoren, bekannte Auslegung und Steriltechnik.
guter Stofftransport, homogene Durchmischung.
Probenahme und Zellzahlbestimmung mgl..
hohes Scale-up-Potential.
o Nachteile
vergleichsweise hoher regelungstech. Aufwand (T, O2, pH).
O2-Versorgung bei hohen Zelldichten schwierig.
Dichtungsprobleme bei rotierenden Wellen (Gleitringdichtung).
Gefährdung speziell von Microcarrier-Kulturen durch Scherung und Schaum.
Zellrückhaltung für hohe Zelldichten erforderlich.
Mediumperfusion begrenzt.
Skizzieren Sie den prinzipiellen Aufbau eines Festbettreaktorsystems. Welche Geometrie eignet sich für eine Scale-up von Festbettreaktoren?
o radiale Durchströmung.
Benennen Sie jeweils 3 Vor- und Nachteil von Festbettreaktoren.
o Vorteile
hohe V-bezogene Zelldichte und somit Produktivität.
geringe Scherbelastung.
einfacher Mediumwechsel und Produkt/Zell-Trennung.
bei Festbett einfaches Scale-up mit radial durchströmter Geometrie.
Produktivität kann über lange Zeit auf einem hohen Niveau gehalten werden.
o Nachteile
nicht-homogenes System.
Bestimmung der Zellzahl/-ernte nicht mgl..
Gefahr der Verblockung speziell bei Festbettreaktoren mit kleinen Trägern.
bei Wirbelschicht Scale-up hinsichtlich O2-Eintrag schwierig.
Welches Reaktorsystem stellt die folgende Abbildung dar?
Beschreiben Sie das Funktionsprinzip. Sind diese Reaktortypen scale-up-fähig? (Begründung)
o Hohlfaser-Reaktor.
o Ein Hohlfaser-Reaktor besteht aus tausenden Hohlfasern, die ein Kapillarsystem simulieren. Tech. handelt es sich um die Kombination einer Ultrafiltrationseinheit und eines Bioreaktors. Durch die semipermeable Membran der Hohlfasern werden Zellen zurückgehalten respektive vom durchfließenden Medium getrennt, sodass nur der Durchtritt meist niedermolekularer Produkte und Metabolite mgl. ist. Dadurch wird eine höhere Produktreinheit und ein effektiver Schutz vor Scherschäden gewährleistet.
o Scale-up nur sehr beschränkt mgl..
Löslichkeit von Gas in Zellkulturmedium sinkt bei Erhöhung der T.
Pumpendesign für benötigten V-Strom schwierig, ohne dass biol. Komponenten denaturiert werden oder signifikanter Gegendruck entsteht.
Die grobe Filtrationsrate (Austauschrate von Nährstoffen und Abfallstoffen) von cellulosischen Hohlfasern ist zu niedrig um die Kultivierung von adhärenten Zelllinien (CHO, HEK293, etc.) zu unterstützen.
Die Fasern sind nicht einheitlich verteilt, sodass es bei großer Faserdistanz zu nekrotischen Arealen kommt.
Was versteht man unter „Single-use“-Bioreaktoren? Geben Sie 2 Beispiele.
o Der „Single-use“-Bioreaktor ist ein Bioreaktor bei dem die Teile, die mit dem Kulturmedium in Kontakt geraten aus Einwegmaterial hergestellt sind.
o Beispiele
wave-mixed bag bioreactor.
gerührte „Single-use“-Bioreaktoren.
„Single-use“-Bioreaktor mit Vibromixer.
Zeichnen Sie für einen fed-batch mit festem Zulaufstrom prinzipiell die zeitlichen Verläufe von Zellkonzentration, Substratkonzentration und Zulaufstrom.
bild
Welche Probleme müssen bei fed-batch-Prozessen berücksichtigt werden?
o exp. Wachstum (Bedarf an Nährstoffen und O2 (bei aeroben MOs) steigt in ähnlicher Weise (ggfs. O2-Limitierung)).
o häufig Veränderungen im Metabolismus der Zellen während einer Kultivierung oder zw. aufeinander folgenden Kultivierungen.
o Zulaufmedium beim fed-batch stark konzentriert (Überfütterung, Bildung und Anreicherung inhibierender Metabolite).
o während des Prozesses stehen nur wenige Größen als online-Messgrößen zur Verfügung (Steuerungs- respektive Regelungsstrategien schwierig).
o Kontrolle des Prozesses bei niedrigen Substrat-c vorteilhaft, aber ggfs. verringertes Zellwachstum oder Absterben der Zellen.
Benennen Sie für fed-batch-Prozesse drei Fütterungsstrategien (Einstellung des Zulaufstromes) ohne zusätzliche Messdaten aus dem Prozess.
o repeated-batch (Impulszugabe).
o fester Zulaufstrom.
o lin. Zunahme des Zulaufstroms.
o exp. Zunahme des Zulaufstroms.
Benennen Sie für fed-batch-Prozesse drei Fütterungsstrategien (Einstellung des Zulaufstromes), bei denen zusätzliche Messdaten aus dem Prozess genutzt werden. Welche würden Sie für Zellkulturprozesse empfehlen?
o Fütterung anhand direkter Messung des Substratverbrauchs.
o Regelung auf vorgegebener Substrat-c (μ-stat).
o Proportionalfütterung auf Basis der zugegebenen Menge an Lauge oder Säure.
o bevorzugt Proportionalfütterung mittels Trübungsmessung (Zellzahlbestimmung).
o Proportionalfütterung mittels O2-Aufnahme (oxygen uptake rate, OUR).
o oxygen probing.
Warum eignen sich Experimente im Chemostat besser als batch-Experimente für die Bestimmung kinetischer Parameter?
o Ein Chemostat eignet sich sehr gut zur Bestimmung kinetischer Parameter, insbesondere zur Wachstumskinetik, da sich durch einfache Variation der Zu- und Abflussrate ganz gezielt eine bestimmte Wachstumsrate einstellen lässt. Insbesondere der kritische Bereich niedriger Wachstumsraten lässt sich durch den Chemostat sehr viel besser abbilden als durch einen Batch-Versuch. Zudem sind die aus stationären Zuständen ermittelten Daten verlässlicher.
Welcher Transportmechanismus liegt bei der Dialyse vor? Wie hängen Permeationskoeffizient und Molekulargewicht zusammen? Wofür steht der „cut off“-Wert für eine Dialysemembran?
o Die Dialyse ist definiert als der Transport einer gelösten Komponente von einer homogenen Phase durch eine Membran in eine andere homogene Phase unter der treibenden Kraft eines c-Gradienten.
o Analog zum 1. FICKschen Gesetz gilt ( ) mit N = Molenstrom, Pges = Permeationskoeffizient, A = Austauschfläche, Δc = c-Gradient. Bei const. Betriebsbedingungen nimmt Pges mit steigendem Molekulargewicht stark ab.
o Bei hohen Molekulargewichten kommt der Stoffstrom fast völlig zum Erliegen. Man spricht dann vom „cut off“ der Membran.
Benennen Sie 4 wesentliche Gründe, wann eine Perfusionskultur im Vergleich zum batch/fed-batch von Vorteil ist.
o kontinuierliche Kultivierung.
o fragile, glykosylierte Proteine.
o niedrige Verweilzeit der Produkte.
o sehr hohe Zelldichten.
o hoher Lebendanteil.
o hohe volumetrische Duchsatzraten.
