Biochemie I

Die Säurekonstante K_s ist eine Stoffkostante und gibt Aufschluss darüber, in welchem Maße ein Stoff in einer Gleichgewichtsreaktion mit Wasser unter Protolyse reagiert
Je kleiner der pK-Wert, desto stärker ist die Säure.

Bei pH=pK liegt die As zu gleichen Teilen in der protonierten und der deprotonierten Form vor.

pH = pI = isoelektrischer Punkt
Die As besitzt in diesem Punkt keine elektrische Nettoladung und wandert nicht im elektrischen Feld.
\(pI = {pK1+pK2 \over 2}\)
 

Im physiologischen pH‐Bereich (pH ~ 7) hat nur Histidin eine nennenswerte Pufferwirkung

Die Löslichkeit eines Proteins wird u.a. stark durch den pH-Wert der Umgebung beeinflusst und erreicht am isoelektrischen Punkt ein Minimum.

Schon eine oberflächliche Betrachtung zeigt, dass die As-Zusammensetzung ein spezifisches Merkmal für ein bestimmtes Protein ist. Im Allgemeinen ist keine direkte Beziehung zwischen As-Zusammensetzung und der räumlichen Struktur oder gar der Funktion des Proteins ersichtlich.

In gewissen Extremfällen hängt aber die Struktur und Funktion eines Proteins vom Vorhandensein einer grossen Zahl bestimmter As-Reste ab, welche deshalb schon bei der As-Zusammensetzung auffallen:
z.B. Histon 2A, Kollagen, Keratin (siehe andere Karten)
 

Dieses Protein kommt im Chromatin des Zellkerns vor. Es ist ein stark basisches Protein mit einem hohen Gehalt an positiv geladenen Lysin-Resten. Histon 2A kann somit an die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA binden.

Posttranslationelle Modifikation der Histone durch Phosphorylierung verhindert ihre Bindung an die DNA.

Dieses Faserprotein des Bindegewebes bildet langgestreckte, seilartige Strukturen, deren Bildung durch ihren Gehalt an Gly, Pro, HO-Pro, HO-Lys ermöglicht wird.
HO-Pro und HO-Lys kommen ganz selten in anderen Proteinen vor, sind aber sehr typisch für das Kollagen. Sie dienen als Ansatzpunkte für kovalente Quervernetzungen. Für HO-Pro und HO-Lys existieren keine eigenen genetischen Codeworte (Basentriplett), das heisst ihre Seitenketten werden nach der Synthese der Peptidkette hydroxyliert (posttranslationelle Modifikation).

Dieses Protein bildet die Haare und andere Hautanhangsgebilde.
Es enthält sehr viel Cystin. Die Disulfidbindungen des Cystins halten einzelne Polypeptidketten zusammen und geben dem Haar mechanische Festigkeit.

Die Ladungseigenschaften der Proteine leiten sich von den Ladungseigenschaften der As ab, soweit diese beim Einbau in die Polypeptidkette erhalten bleiben.

Die Amidgruppe (Peptidbindung: -NH-CO-) ist elektrisch neutral --> weder basische noch saure Eigenschaften.
Die α-NH₂- und α-COOH-Gruppen mit Ausnahme derjenigen an den Enden der Kette, tragen deshalb nichts zur Ladung eines Polypeptids bei.
Die Ladungseigenschaften von Peptiden oder Proteinen werden demnach in erster Linie durch die  Ladungsverhältnisse an den Seitenketten bestimmt.

Die Ladung der einzelnen Gruppen hängt nach Massgabe ihres pK’s vom pH des Milieus ab. Die pK-Werte können nur ungefähr angegeben werden, da sie je nach ihrer Mikroumgebung im jeweiligen Protein verschieden sein können.

Wie die As sind auch die Proteine Ampholyte, denn je nach pH der Lösung kann ihre Gesamtladung positiv, negativ oder auch null sein:
sauer (pH 1)      H₃N+-Val-Asn-Asp-Lys-Ala-COOH    2+     Kation
neutral      H₃N+-Val-Asn-Asp-Lys-Ala-COO-    0      Zwitterion
basisch (pH 13)     H₂N-Val-Asn-Asp-Lys-Ala-COO-    2-      Anion

Wie Aminosäuren weisen demnach auch Proteine einen isoelektrischen Punkt auf.

1. Trägerelektrophorese:
• Die Probelösung wird als schmale Zone auf einen mit Pufferlösung getränkten Träger (z.B.Celluloseacetatstreifen) aufgetragen.
• Der Träger wird während einer bestimmten Zeit (30 min) einer Gleichspannung ausgesetzt. --> Die Moleküle wandern im elektrischen Feld gegen die Anode oder Kathode.
• Nachweis der Wanderung durch Anfärben der Peptide oder Proteine mit einem Farbstoff.

2. pH-Titration von Peptiden oder Proteinen:
Die pH-Titrationskurve eines Proteins entspricht der Summe der Titrationskurven aller ionisierbaren Gruppen (v.a. Seitenketten). Bei vielen Proteinen zeigt sie deren Pufferwirkung im physiologischen Bereich (v.a. durch His bedingt). Proteine sind wichtige Puffer im Blut und in den Zellen.

Die speziellen Eigenschaften und Funktionen eines Proteins werden ausser durch die As-Zusammensetzung in ganz entscheidendem Masse durch die Reihenfolge der As in der Polypeptidkette bedingt. Proteine mit gleicher As-  Zusammensetzung aber ungleicher Sequenz der As sind nicht identisch!

Bei Änderung des pH-Wertes der Pufferlösung, mit welchem der Trägerstreifen getränkt ist, ändert sich die Wanderungsrichtung eines Proteins. Der pH-Wert der Pufferlösung, bei dem das Protein nicht mehr wandert, entspricht dem isoelektrischen Punkt.
Die Elektrophorese wird vor allem als Trennverfahren für Proteingemische angewandt.
Wanderungsgeschwindigkeit = f (Nettoladung, retardierende Kräfte)
(bei gegebener Feldstärke: V/cm)

Hydrodynamische Reibung, sterische Effekte des Trägermaterials, Adsorption (ein Vorgang, mit dem Festkörper an ihrer Oberfläche Moleküle eines anderen Stoffes binden können) an das Trägermaterial.

Sind zwei Proteine in einer der Eigenschaften, welche die Wanderungsgeschwindigkeit beeinflusst, verschieden, werden sie durch Elektrophorese getrennt. Schon der Unterschied in einer einzigen sauren oder basischen As führt zu einem deutlich unterschiedlichen Verhalten bei der Elektrophorese.

Proteine             Beispiel  -  ΙEP   -  Ladung bei pH 7   -  Prädominante AS
Saure:  ΙEP<7        Pepsin   -  2.9    -  stark negativ         -     Asp, Glu
Neutrale:  ΙEP~7      Hb      -   7.1   -     ~0                      -   saure ~ basische
Basische:  ΙEP>7   Histone  - 10.8   -  stark positiv          -     Lys, Arg

1. Herstellung von Bruchstücken (kürzere Peptide):
Die direkte Bestimmung der Sequenz (Edman-Abbau) ist nur bei kürzeren Peptiden möglich.
Das Protein muss daher chemisch oder enzymatisch an spezifischen Stellen gespalten werden.
Beispiel: Enzymatische Spaltung mit Trypsin und Chymotrypsin.
2. Isolierung der Peptide (Chromatographie)
3. As-Sequenzbestimmung der Peptide:
Chemisch (Edman-Abbau) oder enzymatisch wird von einem Ende her eine As um die andere abgespalten und identifiziert. Hierfür gibt es heute Maschinen (Sequenatoren), die einen solchen Abbau von kürzeren Peptiden zum Teil automatisch durchführen.
4. Bestimmung der Reihenfolge der Peptide:
Durch Vergleichen zweier Sätze (Beispiel Trypsin und Chymotrypsin) von überlappenden Peptidbruchstücken muss man die einzige widerspruchsfreie Anordnung suchen.

!Proteine mit gleicher As Zusammensetzung aber ungleicher Sequenz der As sind nicht identisch!

Die erste Sequenzbestimmung war die von Insulin, einem Protein aus zwei Peptidketten mit insgesamt 51 As.
F. Sanger arbeitete an dieser Bestimmung von 1945 – 1955. Auch heute erfordert die Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins von 400 As immer noch viel Zeit.

Die Nucleotidsequenz der DNA wird jedoch durch raschere und einfachere Methoden bestimmt, setzt aber die Isolierung der entsprechenden DNA voraus.
Von der Nucleotidsequenz kann mit Hilfe des genetischen Codes die As-Sequenz abgeleitet werden. Dies wird heute meist angewendet, da die Genome vieler Organismen sequenziert sind. Sogenannte offene «Leseraster» erlauben dann die Reihenfolge der AS im Protein zu bestimmen.

a)             1      2      3      4      5
b) H2N - Ala - Ser - Ile - Phe - Lys - COOH
c)   Alanyl-Seryl-Isoleucyl-Phenylalanyl-Lysin

a. Nummerierung vom N-Terminus zum C-Terminus entsprechend der Richtung der Biosynthese
b. Dreibuchstabenabkürzungen für As
c. Peptid als Acylderivat der C-terminalen As bezeichnet

Linearität der Peptidkette:
• keine Verzweigungen
• keine Ringstrukturen (Ausnahme: zyklische Peptide)
Absolut definierte Sequenz:
Die lineare Genstruktur findet ihr direktes Abbild in der linearen Proteinstruktur.
Vergleich von Proteinstrukturen:
Sequenzvergleiche verschiedener Proteine ermöglichen den Verwandtschaftsgrad zwischen diesen Proteinen zu ermitteln.

Myoglobin und Hämoglobin sind ähnlich, aber geringfügige Unterschiede in der Struktur lassen sie unterschiedliche Funktionen ausführen.

Myoglobin: vorkommend in Muskeln, O₂-Speicher, Kettenlänge von 153 As, Anzahl Peptidketten: 1/Molekül (Monomer)
Hämoglobin: vorkommend im Blut (Erythrozyten), O2-Transporter, Kettenlänge 2 α-Ketten [je 141 As], 2 β-Ketten [je 146 As], Anzahl Peptidketten: 4/Molekül (Tetramer)

Wenn man z.B. As-Sequenzen des Pottwal-Myoglobins und der α- und β-Kette von Pferde-Hämoglobin vergleicht, zeigt bereits die oberflächliche Betrachtung, dass an gewissen Stellen immer wieder die gleichen As-Reste auftreten.
--> Diese offensichtliche Ähnlichkeit in der AS-Sequenz zwischen Globinketten verschiedener Spezies oder innerhalb derselben Spezies wird Sequenzhomologie genannt. Sie ist die Folge des gemeinsamen evolutionären Ursprungs dieser Proteine.

Oft ergibt sich das klare Bild einer Homologie erst, wenn in die Sequenzen «Lücken» (Deletionen) eingeführt werden. Diese Deletionen existieren in Wirklichkeit nicht als «Lücken». Sie sind bloss Zeugen davon, dass im Laufe der  Evolution As eliminiert oder zusätzlich eingeschoben worden sind.

• Die Ähnlichkeit in der Sequenz nimmt mit evolutionärer Distanz ab. Die phylogenetische Distanz verschiedener Spezies lässt sich aus morphologischen Vergleichen und paläontologischen Untersuchungen ermitteln.
• Die Änderungsgeschwindigkeit bleibt für ein gegebenes Protein über Jahrmillionen ungefähr konstant («Proteinuhr»).
• Die Änderungsgeschwindigkeit ist für verschiedene Proteine verschieden.
• Aufgrund solcher Daten und Überlegungen lassen sich Stammbäume verschiedener Proteine aufstellen (Beispiel: Globinketten).

Ein Protein kann durch eine Mutation in einer Weise verändert werden, dass es seine biologische Funktion nicht mehr oder nur noch teilweise erfüllen kann.

Molekulare Krankheiten spielen in der Veterinärmedizin eine grosse Rolle. Sie können oft durch Sequenzuntersuchungen eindeutig erklärt werden. Schon der Austausch einer As kann zur Manifestation einer solchen Krankheit genügen.
(Die am besten untersuchte molekulare Krankheit beim Hund, ist die Phosphofruktokinaseinsuffizienz)

Proteine sind dreidimensionale Gebilde, zu deren vollständigen Beschreibung die Kenntnis der Struktur im Raum gehört.
Die Faltung der an den Ribosomen entstehenden Polypeptidkette zur nativen Konformation erfolgt spontan durch Selbstorganisation. Ein direkter Hinweis dafür ist die spontane Synthese der Polypeptidkette aus AS. Offenbar enthält die As-Sequenz die Information, welche die Faltung leitet und bestimmt. Dazu sind weder Enzyme noch Matrizen notwendig.

1. Die kovalente Struktur (Primärstruktur) bestimmt vollständig und allein die Kettenkonformation.
2. Die native Konformation entsteht, weil sie unter den in der Zelle herrschenden Bedingungen die wahrscheinlichste Konformation, das heisst, diejenige mit kleinster freier Enthalpie (G), ist.
--> das Protein sucht die energiegünstigste Struktur --> faltet sich in folge dessen zusammen

Konsequenz: Es sollte möglich sein, die native Konformation aufgrund der As-Sequenz vorauszusagen.
--> Dazu müssten jedoch alle physikalisch-chemischen Eigenschaften der Peptidkette und der Seitenketten und deren Wechselwirkungen genau bekannt sein.

Die Faltung globulärer Proteine ist ein intramolekularer Vorgang. Er kommt zustande durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen, in der Sequenz oft weit auseinanderliegenden Abschnitten der Polypeptidkette. An diesen Wechselwirkungen sind sowohl die Hauptkette als auch die Seitenketten beteiligt.

Es gibt zwei Gruppen von faltungsbestimmenden Faktoren:
1. Stereochemische Eigenschaften der Kette (Raumbeanspruchung der einzelnen Gruppen, Drehbarkeit um Bindungen).
2. Die Wechselwirkungen, welche zwischen den einzelnen Kettenabschnitten auftreten und die Faltung stabilisieren.
--> am wichtigsten sind:
• zwischen polaren Gruppen: H-Bindungen
• zwischen apolaren Gruppen: Hydrophobe Effekte
• zwischen geladenen Gruppen: Elektrostatische Wechselwirkungen
Bei einzelnen (besonders extrazellulären) Proteinen kommen noch kovalente intramolekulare Querverbindungen dazu (Disulfidbindungen).

Da die Faltung durch die Primärstruktur bestimmt wird, zeigt sie in ihrer Organisation zwei einander entgegengesetzte Tendenzen:

1. Die Hauptkette mit ihrer regelmässigen Struktur fördert die Tendenz zu einem regelmässigen Faltungsmuster.
2. Die Seitenketten mit ihren unregelmässigen Strukturen sind verantwortlich für ein unregelmässiges Faltungsmuster.

--> Die verwirklichte Faltungsform der meisten Proteine entspricht einem Kompromiss zwischen beiden Tendenzen.
Die Kenntnis dieser beiden entgegengesetzten Faltungsarten ist die Grundlage für das Verständnis der hierarchischen Organisation der Raumstruktur von Proteinmolekülen.

Sequenz der Aminosäuren

Peptidbindung (=Amidbindung) kovalente Bindung!

Abschnitte regelmässiger Faltung (z.B. α-Helix, Faltblattstrukturen)

Wasserstoffbindung zwischen Amidgruppen der Hauptkette

Räumliche Gesamtstruktur einer Polypeptidkette (Hauptkette und Seitenketten) bestehend aus regelmässig und
unregelmässig gefalteten Abschnitten

Hydrophobe Effekte
Wasserstoffbindungen
a) zwischen Amidgruppen der Hauptkette
b) zwischen Amidgruppen der Hauptkette und polaren Gruppen von Seitenketten
c) zwischen polaren Gruppen von Seitenketten
nicht in allen Proteinen vorkommend: Salzbindungen zwischen geladenen Gruppen Disulfidbindungen (kovalente
Bindung!)

Zusammenlagerung von zwei oder mehreren Polypeptidketten mit eigener Tertiärstruktur zu einem stabilen oligomeren Proteinmolekül. (Eine Minderzahl von Proteinen besteht nur aus einer einzigen Polypeptidkette und besitzt somit keine Quartärstruktur.)

Gleiche Bindungstypen wie in Tertiärstruktur:

[Hydrophobe Effekte
Wasserstoffbindungen
a) zwischen Amidgruppen der Hauptkette
b) zwischen Amidgruppen der Hauptkette und polaren Gruppen von Seitenketten
c) zwischen polaren Gruppen von Seitenketten
nicht in allen Proteinen vorkommend: Salzbindungen zwischen geladenen Gruppen Disulfidbindungen (kovalente
Bindung!)]

Die Peptidbindung (Amidbindung) stellt ein Resonanzsystem dar, das durch zwei mesomere Formen (Grenzstrukturen) beschrieben werden kann.
Die tatsächlich vorhandene Struktur lässt sich am besten durch ein Resonanzhybrid darstellen.

Konsequenzen:
1. Wichtigste sterische Konsequenz: Durch partiellen Doppelbindungscharakter der C-N-Bindung wird deren freie Drehbarkeit eingeschränkt. --> Damit wird die Peptidbindung planar.
Freie Drehbarkeit gibt es nur noch um die C-αC-und N-αC-Bindung. (Die Peptidkette kann als Reihe von Ebenen, die durch substituierte Methylgruppen (-CHR-) voneinander getrennt sind, angesehen werden.)
2. Damit zusammenhängende wichtigste chemische Konsequenz: Die Elektronendelokalisation führt zu  Partialladungen am O- und N-Atom der Peptidbindung:
• Das O-Atom, partiell negativ geladen, wird nucleophiler und somit zu einem H-Akzeptor.
  --> Ein solches O-Atom zeigt erhöhte Tendenz, H-Bindungen zu bilden.
• Das N-Atom, partiell positiv geladen, wird weniger nucleophil und somit zu einem H-Donor.
  --> Das N-gebundene H-Atom zeigt demnach eine erhöhte Tendenz, H-Bindungen einzugehen.

1. Wahrung der Planarität der Peptidbindung
2. Ausbildung einer maximalen Anzahl von H-Bindungen zwischen den Amidbindungen (eine H-Bindung pro As-Rest)
3. Optimale Bindungslängen und Bindungswinkel für H-Bindungen.

Diese Anforderungen werden durch die α-Helix und das β-Faltblatt erfüllt.

(Sekundärstruktur)
(α, weil es die erste Struktur war, die postuliert wurde)
1. Die Peptidkette ist schraubenartig (helical) rechtshändig aufgewunden.
2. Die H-Bindungen innerhalb derselben Kette stehen mehr oder weniger parallel zur Helixachse. Eine Peptidgruppe bildet immer mit der viertnächsten Peptidgruppe eine H-Bindung.
3. Die starren Ebenen der Peptidbindungen sind parallel zur Längsachse der Helix angeordnet.
Die Helix bildet keinen Zylinder, sondern eine eckige Struktur (α-C-Atome in den Ecken).
  • Auf eine Windung kommen 3.6 As-Reste
  • Die Ganghöhe ist 5.4 Å
4. Die Seitenketten sind radial nach aussen orientiert.

Met, Ala, Leu, Glu, Lys