Biochemie I

Wenn in einem multimeren Protein (zum Beispiel Enzym) eine erste Untereinheit durch Bindung eines Effektors eine Konformationsänderung erhält und diese den anderen Untereinheiten übermittelt, so spricht man von Kooperativität.

Die Untereinheiten handeln dann nicht individuell, sondern "sprechen" sich über das weitere Vorgehen miteinander ab.

Es gibt positive und negative Kooperativität. Das klassische Beispiel für positive Kooperativität findet sich beim
Hämoglobin.

Das Beispiel der Kooperativität des Hämoglobins entspricht einem homotrop regulatorischen Enzym. Obwohl das Hämoglobin nicht ein Enzym ist, wird dessen Kooperativität hier stellvertretend im Detail erklärt, da es für das physiologische Verständnis des Sauerstofftransportes ausserordentlich wichtig ist.

Hämoglobin ist ein tetrameres Hämprotein. Es besteht aus 2 α-Globin- und 2 β-Globinuntereinheiten. Diese unterscheiden sich geringgradig in ihrer Primärstruktur (Aminosäuresequenz). Als prosthetische Gruppe dient Häm. Dabei handelt es sich um einen roten Eisenprotoporphyrinkomplex.
--> Dieser besteht aus einem Makrozyklus aus 4 untereinander verbundenen Pyrrolringen, deren Stickstoffatome zweiwertiges Eisen komplexieren.
--> Häm ist aufgrund seines aromatischen Charakters eine flache Scheibe. Diese steckt in den Hämtaschen des Globins.
Die Globine sind im Hämoglobin tetraedrisch angeordnet.

Die Globinuntereinheiten existieren in 2 Konformationen, die als Desoxykonformation, beziehungsweise Oxykonformation bezeichnet werden.
In nicht-oxygeniertem Hämoglobin liegen alle Globinuntereinheiten in der Desoxykonformation vor, in voll  oxygeniertem Hämoglobin weisen alle Untereinheiten die Oxykonformation auf. In teilweise oxygeniertem Hämoglobin existieren beide Konformationen nebeneinander.

* Der Grund für die schrittweise Konformationsumwandlung bei zunehmender Beladung mit Sauerstoff liegt in der homotrop-positiven Kooperativität der Globinuntereinheiten. Je eine α- und eine β-Globinkette bilden zusammen eine funktionelle Einheit.

* In der Desoxykonformation ist das Hämeisen durch Bindung an einen Histidinrest (His) aus der Hämebene  herausgezoge --> diese gespannte Konformation wird durch ein System von Bindungen (Wasserstoffbrücke zu einem Tyrosinrest am karboxyterminalen Ende des Globins und ionische Bindung zur benachbarten Globinuntereinheit) aufrechterhalten.
* Bei der Besetzung des ersten Häms mit Sauerstoff wird das Hämeisen in die Hämebene gezogen --> da die Wasserstoffbrücke zum Histidin relativ stabil ist, wird Struktur und Funktion die zugehörige Proteinschlaufe nach rechts gezogen --> dadurch reisst die Wasserstoffbrücke zum Tyrosin (Tyr) --> das karboxyterminale Ende der β-Globinkette klappt nach links-unten weg und unterbricht damit die ionische Bindung zur α-Globinkette.
--> die β-Globinuntereinheit liegt jetzt in der Oxykonformation vor und ist mit Sauerstoff beladen.

* Das Abreissen der ionischen Bindung zwischen β- und α-Globin löst nun im α-Globin dieselben Reaktionen in der umgekehrten Reihenfolge aus: --> das karboxyterminale Ende der α-Globinkette klappt nach rechts-oben --> die Wasserstoffbrücke zwischen Tyrosin und der benachbarten Proteinschlaufe reisst --> die Proteinschlaufe weicht unter dem Zug der Histidin-Eisenbindung nach links --> gestattet damit dem Hämeisen, in die Hämebene zurückzukehren.
Durch diesen Ablauf hat die α-Globinuntereinheit die Oxykonformation angenommen, ohne einen Sauerstoff aufgenommen zu haben.

Die leere Oxykonformation hat eine höhere Affinität zum Sauerstoff als die Desoxykonformation.
--> Deswegen wird bei Zutritt eines zweiten Sauerstoffs zum Hämoglobin zuerst die Untereinheit mit der leeren Oxykonformation besetzt, während die beiden Globine in der Desoxykonformation vorerst leer bleiben.
Durch kooperative Konformationsumwandlung gehen schliesslich auch diese in die Oxykonformation über und werden schrittweise mit Sauerstoff beladen.

Der geschilderte Mechanismus erklärt, warum von 2 Hämoglobin-Molekülen, die mit O₂ in Berührung kommen immer zuerst eines mit Sauerstoff voll beladen wird, bevor das andere ebenfalls zum Zuge kommt.

Der rote Blutfarbstoff Hämoglobin ist ein tetrameres Hämoportein. Es zeigt positive Kooperativität seiner Untereinheiten bezüglich Sauerstoffaffinität.
Myoglobin, ein sauerstoffbindendes Protein des Muskels, ist ein monomeres Hämprotein. Die Struktur des Myoglobins gleicht derjenigen einer einzelnen Hämoglobinuntereinheit sehr stark. Weil Myoglobin aber ein Monomer ist, kann es per definitionem keine Kooperativität zeigen.

Die Kooperativität des Hämoglobins und die Nicht-Kooperativität des Myoglobins drücken sich in ihren Sauerstoffbindungskurven aus.

Nicht-Kooperativität ergibt immer eine hyperbolische (Form einer Hyperbel aufweisende) Kurve.
Homotrop-positive Kooperativität ergibt immer eine sigmoide (s-förmige) Kurve.

Durch die verschiedenen Kurvenformen sind Hämoglobin und Myoglobin ihren besonderen Funktionen optimal angepasst.

Der Sauerstoffgehalt des Hämoglobins wird in Ruhe nur zu etwa 30% ausgeschöpft; 70% bleiben als Reserve. Diese wird dann eingesetzt, wenn der pO₂ im venösen Blut unter die Norm abfällt:
• physiologischerweise wegen starker körperlicher Anstrengung oder im Hochgebirge
• pathologischerweise bei Hypoventilation oder Herzinsuffizienz.

Myoglobin befindet sich innerhalb der Muskelzelle, also am Ort des Sauerstoffverbrauchs, wo der pO₂ um 10 mmHg liegt. Deswegen ist es günstig, dass Myoglobin sein O₂ erst bei diesen tiefen pO₂ abgibt.

Die Sauerstoffbindungskurve des Hämoglobins wird ausser durch den O₂-Partialdruck auch durch Blut-pH und Temperatur beeinflusst.
Niedriges pH und hohe Temperaturen erleichtern die O₂-Abgabe. Dies bringt funktionelle Vorteile. Im metabolisch aktiven Gewebe ist nämlich der pH tief (wegen der CO₂-Produktion) und die Temperatur hoch (wegen der Wärmeproduktion).

Damit wird Sauerstoff bevorzugt an metabolisch aktives Gewebe abgegeben, welches auf eine besonders gute Sauerstoffversorgung angewiesen ist.

Die Verschiebung der Sauerstoffbindungskurve durch pH-Änderungen wird Bohr-Effekt genannt.

2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG)  ist ein Regulator der Sauerstoff-Bindung an Hämoglobin. 2,3-DPG bindet nichtkovalent an Desoxyhämoglobin, jedoch nicht an Oxyhämoglobin, wodurch die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins um den Faktor 26 verringert wird. In der Sauerstoff-Dissoziationskurve macht sich dies in einer Verschiebung der Kurve nach rechts bemerkbar.

Die molare 2,3-DPG-Konzentration in den Erythrocyten ist unter Normalbedingungen etwa gleich groß wie die des Hämoglobins. Daraus erklärt sich, dass (isoliertes) freies Hämoglobin in Lösung eine deutlich höhere Sauerstoff-Affinität hat als das Hämoglobin in Erythrocyten. Bei mangelhafter Versorgung der Gewebe mit Sauerstoff kann sich die Konzentration an 2,3-DPG entsprechend anpassen. Beim Übergang in größere Höhen wird beispielsweise mit der Zeit die 2,3-DPG-Konzentration erhöht und damit die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins verringert, so dass der Sauerstoff auch unter diesen Bedingungen im Gewebe aus den Erythrocyten abgegeben werden kann.

Fötales Hämoglobin kann im Körper Sauerstoff deutlich besser binden als das Hämoglobin von Erwachsenen, wodurch der Transfer von Sauerstoff vom mütterlichen in den fötalen Blutkreislauf unterstützt wird. In freier Form dagegen weist fötales Hämoglobin sogar eine etwas geringere Affinität auf. Auch für diesen Effekt ist das 2,3-DPG verantwortlich. Fötales Desoxyhämoglobin bindet nämlich den Regulator weitaus schlechter, woraus eine bessere Bindung von Sauerstoff resultiert.

Die Enzymkinetik beschreibt die quantitative Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von Substrat- und Enzymkonzentration.

Eine Enzymreaktion lässt sich in 2 Teilschritte zerlegen.
Im ersten (schnellen) Schritt findet das Enzym (E) sein Substrat (S) und bildet mit ihm einen Enzym-Substrat-Komplex (ES).     [--> wird beschrieben durch das Massenwirkungsgesetz]
Im zweiten (langsamen) Schritt vollzieht sich die chemische Umwandlung des Substrats, worauf der Komplex in Enzym (E) und Produkte (P) zerfällt

Die Geschwindigkeit (v) der Gesamtreaktion misst sich anhand der Konzentrationsänderung des Substrats pro  Zeiteinheit (Substratumsatz pro Zeiteinheit).
v hat die Dimension μMol · Liter-1·min^-1.
Im allgemeinen verläuft der erste Schritt so schnell, dass er die Gesamtgeschwindigkeit kinetisch nicht beeinflusst. Geschwindigkeitsbestimmend ist lediglich der zweite, langsame Schritt, der eine Art Engpass darstellt.

Die Geschwindigkeit einer Reaktion ergibt sich allgemein aus:
\(v = k*[Ausgangsmaterial] \)
wobei k die Geschwindigkeitskonstante ist. Da in unserem Fall lediglich der zweite Schritt  geschwindigkeitsbestimmend ist, ergibt sich für die Enzymreaktion:
\(v = k2* [ES]\)
[ES], die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes, wird bestimmt durch das Massenwirkungsgesetz im ersten Schritt:
\(KD= {[E]*[S] \over [ES]}\) oder \([ES] = {[E]*[S] \over KD}\)
Daraus ergibt sich für die Gesamtreaktion
:\(x = k2*[E]*[S]*{1\over KD}\)
Trotz seiner hohen Geschwindigkeit geht also der erste Schritt auf dem Umweg über das Massenwirkungsgesetz
ebenfalls in die Geschwindigkeitsgleichung ein.

Die Reaktionsgeschwindigkeit abhängt von [E] (Enzym), [S] (Substanz) und 1/KD sowie einer Geschwindigkeitskonstanten, welche für die Reaktion charakteristisch ist.

Die Kinetik nicht-regulatorischer Enzyme lässt sich durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschreiben.
--> Dabei entspricht Km (Michaeliskonstante) der Dissoziationskonstanten KD des Enzym-Substratkomplexes (= Beitrag des ersten Schrittes) und V_max enthält die Geschwindigkeitskonstante des zweiten Schrittes.
(siehe andere Karte)

Sie ist ein Mass für die Anzahl von Substratmolekülen, die bei vollständiger Sättigung des Enzyms mit Substrat pro Zeiteinheit ins Produkt umgewandelt werden.

[Wechselzahlen einiger Enzyme:
Name  -   Wechselzahl s^-1
Carboanhydrase  -   600'000
LDH  -   1'000
Chymotrypsin  -   100
DNA-Polymerase  -   15
Lysozym  -  0.5]

V_max ist die maximale Reaktionsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion bei vorgegebener (festgehaltener) Enzymkonzentration im Mess-System. Sie wird erreicht bei [S] = ∞.
Für praktische Belange genügt es, wenn man im Substratüberschuss arbeitet, das heisst, wenn die  Substratkonzentration >10 Km beträgt. Unter diesen Bedingungen sind alle Enzymmoleküle mit Substrat gesättigt.

K_m, die Michaelis-Konstante, ist die Substratkonzentration (in Mol / Liter) bei halber maximaler  Reaktionsgeschwindigkeit.  
Sie ist im allgemeinen identisch mit K_D, der Dissoziationskonstanten des Enzym-Substrat-Komplexes.

V_max ist ein Mass für die Enzymkonzentration (ausgedrückt in Enzymeinheiten / Liter) und steigt linear mit dieser an.

Im Gegensatz dazu ist K_m unabhängig von der Enzymkonzentration und beschreibt lediglich die Affinität des Enzyms für ein Substrat.

Wenn ein Enzym mit geringer Substratspezifität mehrere Substrate umsetzen kann, existiert für jedes Substrat ein eigenes K_m.
Zum Beispiel kann die Hexokinase verschiedene Hexosen phosphorylieren:
Km für Glucose beträgt 0,15 x 10-3 M
Km für Fructose beträgt 1,5 x 10-3 M

Je kleiner Km, desto höher ist die Affinität des Enzyms für ein Substrat, das heisst, umso schneller wird das betreffende Substrat (im obigen Beispiel Glucose) umgesetzt (K_m erscheint in der Michaelis-Menten-Gleichung unter dem Bruchstrich, siehe andere Karte).

Kinetik nicht-regulatorischer Enzyme:      E + S <---> ES ----> P  (ES=Enzym-Substrat-Komplex; P=Produkt)

* Nicht-regulatorische Enzyme gehorchen der Michaelis-Menten-Kinetik.
--> Sie ist charakterisiert durch eine hyperbolische Kurve --> aus dieser lassen sich V_max und K_m entnehmen. Diese Werte brauchen wir zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms.
* Enzym bindet nur ein einziges Substrat
* Es gibt nur einen wichtigen Schritt zwischen ES-Komplex und Produktbildung und die Reaktion ist irreversibel.
* Die Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes bleibt konstant. \({d[ES] \over dt} = 0\)

(Aus einer gebogenen Kurve V_max bestimmen zu wollen ist unsicher, weil es schwierig ist abzuschätzen, bei welcher Substratkonzentration die Kurve die Asymptote (V_max) erreicht. Man formt deswegen die Kurve um, indem man sich erinnert, dass eine Hyperbel in eine Gerade übergeht, wenn man die Messpunkte als Reziproke der Ordinaten- und Abszissenwerte aufträgt. So erhält man das nachfolgende Lineweaver- Burk-Diagramm.)

\(v = {Vmax*[S]\over Km+[S]}\)

Damit lässt sich die Umsatzgeschwindigkeit für jeden Punkt der Michaelis-Menten-Kinetik-Kurve berechnen.

Die Kinetik regulatorischer Enzyme lässt sich nur in Ausnahmefällen durch die Michaelis-Menten- Gleichung beschreiben. Meist sind die mathematischen Beziehungen viel komplizierter. Einige Beispiele folgen:

• Homotrop positiv-modulierte regulatorische Enzyme sind solche, bei denen die Bindung eines Substratmoleküls an einem Protomer durch Kooperativität die Konformation der übrigen Protomere so verändert, dass diese eine höhere Affinität zu weiteren Substratmolekülen erhalten. --> Das Substrat ist also gleichzeitig positiver Modulator.
Die Kinetikkurve zeigt dann typischerweise einen sigmoiden Verlauf. Der Mechanismus ist analog demjenigen der Sauerstoffbindungskurve des Hämoglobins, deren sigmoide Form ebenfalls Folge einer homotrop-positiven Kooperativität ist.
• Homotrop negativ-modulierte regulatorische Enzyme zeigen das Phänomen der Substratüberschusshemmung, da das Substrat gleichzeitig negativer Effektor ist.
Sobald Hemmungen und Aktivierungen vorliegen, spricht man von scheinbarem V_max und scheinbarem K_m (definiert als Substratkonzentration bei halbem scheinbarem V_max) und meint damit die tatsächlich gemessenen Werte, die von den extrapolierten Werten für ungehemmte, beziehungsweise unstimulierte Reaktion abweichen.
• Homotrop positiv- und gleichzeitig negativ-modulierte regulatorische Enzyme besitzen 2 Bindungsstellen für das Substrat:
a. eine aktive Stelle mit hoher Affinität für das Substrat und positiven Regulationseigenschaften
b. eine regulatorische Stelle mit niedriger Affinität für das Substrat und negativen Regulationseigenschaften.
• Heterotrop positiv- und negativ-modulierte Enzyme werden durch Effektoren moduliert, die vom Substrat verschieden sind. Sie zeigen in Anwesenheit der Effektoren ein von der Michaelis- Menten-Kinetik abweichendes Verhalten.
• Gemischt homotrop-heterotrop positiv- und negativ-modulierte Enzyme zeigen die komplizierteste Kinetik, besonders wenn es sich um multivalente Regulation handelt (das heisst viele Effektorstoffe). Meist wird das  scheinbare K_m verändert, seltener das V_max.

Die Wirkung vieler Pharmaka beruht auf der Hemmung von Enzymen (zum Beispiel drosseln manche entzündungshemmende Medikamente die Enzyme, welche an der Bildung von endogenen Entzündungsmediatoren beteiligt sind). Die pharmakologische Hemmung ist sowohl auf regulatorische wie auf nicht-regulatorische Enzyme anwendbar.

Inhibitoren werden oft als Medikamenta verwendet, können aber auch als Insektizide (z.B. Malathion) , als Herbizide (z.B. Glyphosat) oder als Desinfektionsmittel (z.B. Triclosan) eingesetzt werden.

Man unterscheidet folgende Hemmtypen:
• reversible Hemmung
   --> kompetitive Hemmung
   --> nicht-kompetitive Hemmung
   --> unkompetitive Hemmung
• irreversible Hemmung

Glyoxalase I ist ein Ziel für die Entwicklung von Arzneimitteln gegen Bakterien.

(eine reversible Hemmung)

Der Hemmstoff ist dem natürlichen Substrat strukturell im allgemeinen sehr ähnlich. --> Deswegen konkurriert er mit  dem natürlichen Substrat um dessen Bindungsstelle am Enzym, der aktiven Stelle. -->  Dadurch wird die Bindung des natürlichen Substrats erschwert. Es scheint dann, als ob das Enzym eine verminderte Affinität zum Substrat hätte, das heisst K_m wird grösser.
Die kompetitive Hemmung kann dadurch überwunden werden, dass die Substratkonzentration so lange erhöht wird, bis der Hemmstoff aus der Bindungsstelle verdrängt ist. --> Das bedeutet, dass bei starker Erhöhung der Substratkonzentration das ursprüngliche V_max wieder erreicht wird. --> Das heisst, V_max bleibt unverändert.

Der kompetitive Inhibitor hemmt den ersten Schritt der Enzymreaktion.

(eine reversible Hemmung)

Der Hemmstoff ist dem natürlichen Substrat strukturell unähnlich.
Er wirkt auf eine Gruppe, die für die Enzymwirkung unbedingt nötig ist, aber nicht notwendigerweise Teil der aktiven Stelle sein muss.
(z.B. besitzen viele Enzyme obligate SH-Gruppen [Cysteinreste in der Proteinkette], die für die funktionelle Konformation des Enzyms wichtig sind. Stoffe, die solche SH-Gruppen reversibel blockieren [z.B. Schwermetallionen wie Pb2+, Hg2+, Ag+] sind nicht kompetitive Inhibitoren. Sie erlauben dem Substrat freien Zugang zur Bindungsstelle, weshalb Affinität und Km unverändert bleiben. Wegen der strukturellen Unähnlichkeit kann eine Erhöhung der Substratkonzentration den Inhibitor nicht verdrängen. Die Hemmwirkung des nicht-kompetitiven Inhibitors beruht auf der Einschränkung der konformationellen Beweglichkeit des Enzyms [d.h. der Induced Fit ist herabgesetzt], wodurch die Überführung des Substrats in den Übergangszustand erschwert wird. Die Geschwindigkeit des Substratumsatzes wird dadurch gesenkt und V_max wird kleiner.)

Der nicht-kompetitive Inhibitor hemmt den zweiten Schritt der Enzymreaktion.

(eine reversible Hemmung)

Der Hemmstoff reagiert nicht mit dem freien Enzym, aber auch nicht mit dem freien Substrat. Erst mit dem Enzym-Substratkomplex kann er zu einem inaktiven Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplexen reagieren (V_max und K_m verändert).

* Bei diesem Hemmtyp geht der Inhibitor eine kovalente Verbindung mit dem Enzym ein.
* Eine Behandlung nach dem Prinzip der Michaelis-Menten-Kinetik ist nicht möglich.

* Ein typisches Beispiel ist die irreversible Hemmung der Cholinesterase durch Organophosphate (Insektizide, Kampfgifte). --> Diese gehen mit funktionell wichtigen Serinresten der aktiven Stelle des Enzyms eine kovalente Bindung ein und inaktivieren sie.
* Diese Hemmstoffe haben wieder traurige Berühmtheit erlangt, weil sie die Iraker als Kampfgift gegen die Kurden einsetzten.

Ibuprofen hemmt die Cyclooxigenasen I und II (COX-1 & COX-2) die im Organismus für die Bildung von entzündungsvermittelnden Prostaglandinen verantwortlich sind.

Ibuprofen wirkt:
- schmerzstillend (analgetisch)
- entzündungshemmend (antiinflammatorisch)
- abschwellend (antiphlogistisch)
- fiebersenkend (antipyretisch)

In der klinischen Diagnostik spielen Enzymbestimmungen eine grosse Rolle.
--> Dabei werden Serumenzymaktivitäten gemessen. --> Die zur Bestimmung gelangenden Enzyme entstammen den
Geweben. Sie sind dort intrazellulär lokalisiert. Krankhafte Prozesse schädigen die Zellen und lassen Enzyme in die Blutbahn übertreten. Wegen des normalen Zellzerfalls gelangen immer geringe Enzymmengen in das Serum, bei  krankhaften Prozessen steigen jedoch die Serumenzymaktivitäten an.
--> Die Erhöhung einer Enzymaktivität deutet auf eine Erkrankung hin.

Die quantitative Bestimmung ausgewählter Enzyme im Blutserum erlaubt häufig die Organlokalisation einer bestimmten Erkrankung, sowie die Abschätzung der Schwere eines Krankheitsbildes.

1. Wo sitzt die Erkrankung (= Herkunftsorgan der Enzymaktivität)?
2. Stadium des pathologischen Prozesses (akut oder chronisch)?
3. Wie weit reicht die Ausdehnung des Gewebeschadens?
4. Wie lautet die Diagnose der Erkrankung?

Erkrankungen lokalisieren!
Verlauf kontrollieren!

Viele Enzyme zeigen eine ausgesprochene Organlokalisation.
Das ist verständlich, wenn man sich überlegt, dass Organe gewisse Spezialfunktionen ausüben, die eigene  Stoffwechselwege erfordern.
z.B. ist die Bildung des Harnstoffs ausschliesslich auf die Leber beschränkt. Enzyme welche an der Harnstoffbildung teilnehmen (z.B. Ornithin-Carbamyl-Transferase und Arginase) kommen deswegen nur in der Leber vor.

Erkrankungen gehen mit Störungen der normalen Zellfunktionen einher.
Sie führen unter anderem zum Durchlässigwerden von Zellmembranen. Die intrazellulären Enzyme treten deswegen aus der Zelle in die Blutbahn über. Ein Ansteigen der Enzymaktivität im Serum zeigt eine Erkrankung an, die umso stärker ist, je höher der Enzymspiegel steigt.