Biochemie I

Die beiden DNA Stränge einer Doppelhelix sind antiparallel angeordnet --> d.h. ihre Zucker-Phosphat-Rückgrate sind gegenläufig.

* Jedes Nucleotid trägt seine eigene Phosphatgruppe am 5’-Kohlenstoff, während der 3’-Kohlenstoff die Phosphatgruppe des benachbarten Nucleotids bindet.
--> Dies verleiht dem DNA-Strang eine definierte Polarität.
* Am sogenannten 3’-Ende befindet sich an der letzten Desoxyribose eine Hydroxygruppe. Am gegenüberliegenden 5’-Ende schliesst das Zucker-Phosphat-Rückgrat mit einer Phosphatgruppe ab, die am 5’-Kohlenstoffatom des letzten
Nucleotids gebunden ist.

Alle DNA-Polymerase können nur an das freie 3’-Ende eines DNA-Strangs Nucleotide anhängen und nicht an ein 5’-Ende.

Daher kann der neue DNA-Strang nur in 5’→3’-Richtung wachsen.

* An einem Matrizenstrang kann die DNA-Polymerase durch ständigen Anbau von Nucleotiden in der vorgeschriebenen 5’→3’-Richtung einen durchgehenden Komplementärstrang synthetisieren.
* Dabei umgreift die DNA-Polymerase die DNA unmittelbar hinter der Replikationsgabel, bewegt sich am Matrizenstrang entlang und folgt der fortlaufenden Aufgabelung des DNA-Doppelstrangs.
* Der bei diesem Vorgang am Matrizenstrang neu gebildete DNA-Strang wird als Leitstrang bezeichnet.

* Um gleichzeitig den komplementären DNA-Strang zu replizieren, muss die DNA-Polymerase in die andere Richtung arbeiten, also entgegengesetzt der Bewegung der Replikationsgabel.
* Die auf diese Weise synthetisierte DNA wird Folgestrang genannt.

* Wenn sich eine Replikationsblase öffnet, kann die DNA-Polymerase zunächst ein kurzes DNA-Stück entgegen der Laufrichtung der Replikationsgabel synthetisieren.
 --> Wandert die Gabel weiter, wird ein zweites DNA-Stück repliziert, wiederum in Richtung von der Replikationsgabel weg.

* Im Gegensatz zum Leitstrang, der kontinuierlich synthetisiert wird, baut sich der Folgestrang demnach aus kurzen Einzelstücken auf.

* Die Produkte dieser diskontinuierlichen Synthese nennt man nach ihrem japanischen Entdecker Okazaki-Fragmente.
  --> bei Eukaryoten 100 bis 200 Nucleotide lang
  --> bei Prokaryoten 1000 bis 2000 Nucleotide lang

- Leitstrang – neu DNA-Strang, welche kontinuierlich in 5‘-->3‘-Richtung synthetisiert ist
- Folgestrang – neu aus Okazaki-Fragmente gebildete DNA-Strang; synthetisiert diskontinuierlich entgegensetzt der Bewegung der Replikationsgabel

- Sie können ein neues Nucleotid nur an einen bereits existierenden Nucleotidstrang anheften, der zudem schon korrekt mit seinem Matrizenstrang gepaart sein muss.

--> Infolgedessen können die DNA-Polymerasen die DNA-Synthese zwar fortsetzen, aber nicht beginnen (initiieren).
--> dafür wird ein Primer benötigt!

- Primer starten die DNA-Synthese
   --> DNA-Polymerasen kann DNA-Synthese zwar fortsetzen, aber nicht beginnen --> Nucleotide werden von der DNA-Polymerasen an das Ende eines bereits existierenden kurzen Strangs angeheftet, den man als Primer (Starter) bezeichnet. 

- In der Zelle bestehen Primer nicht aus DNA, sondern aus einem kurzen Stück RNA.

• Obschon DNA Polymerasen die DNA Synthese nicht beginnen können, gibt es eine Klasse von Enzymen, welche Oligonukleotid Synthese de novo beginnen können.
  --> Diese Enzyme verwenden jedoch nicht Desoxyribonukleotide als Bausteine, sondern Ribonukleotide.
  --> Sie werden deshalb RNA Polymerasen genannt.
• Primase: eine bestimmte RNA Polymerase, die während der Replikation aus Ribonukleotiden die Primer aufbaut
  (die dann von den DNA Polymerasen verlängert werden)

• Die DNA Polymerase des Leitstrangs braucht nur einen einzigen RNA Primer
  --> da die DNA Synthese auf dem Leitstrang kontinuierlich erfolgt

• Beim Folgestrang benötigt jedes neu entstehende Okazaki Fragment einen eigenen RNA Primer
  --> Später werden diese kurzen RNA Primer wieder entfernt und durch DNA ersetzt.

Enzyme, die Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide aus einem Doppelstrang entfernen können.

• DNA Polymerase, die im Bakterium E. coli den Folgestrang synthetisiert
• setzt sich aus einer DNA Polymerase gekoppelt mit einer 5' --> 3' Exonuklease zusammen.
• Ein einziges Protein kann somit sowohl den RNA Primer eines Okazaki Fragments verlängern, wie auch den RNA Primer des vorangehenden Okazaki Fragments entfernen.

- DNA-Polymerasen
- Ligasen
- Primasen
- Exonukleasen
- Helikasen
- Einzelstrang bindende Proteine

• ein Enzym, das am Verzweigungspunkt der Replikationsgabel angreift
  --> indem es die gepaarten Basen trennt, wodurch die DNA-Einzelstränge erst entstehen
• gleicht damit dem Zipper eines sich öffnenden Reissverschlusses

• Dann heften sich sofort Kopien der Einzelstrang bindenden Proteine (SSB-Proteine) an und verhindern, dass sich die beiden Stränge gleich wieder verbinden.

• Durch Helikasen & SSB-Proteine kommt es zu einer lokalen Entwindung der DNA Doppelhelix.
  --> Mit dem Voranschreiten der Replikationsgabel muss die DNA jedoch weitläufig entwunden werden, was zu erheblichen topologischen Problemen führt.

• DNA-Topoisomerasen können die DNA entwinden, ohne die Doppelhelix überhaupt dabei zu drehen
  --> indem sie Brüche in das DNA-Rückgrat einführen
  --> die Holme der verdrillten Leiter werden also an vielen Stellen durchtrennt, entflochten und anschliessend wieder
repariert.
  --> diese Arbeit läuft parallel zur DNA-Replikation ab und führt schliesslich zu zwei völlig getrennten Doppelhelices

• die verschiedenen Proteine, die an der DNA-Replikation teilnehmen, bilden einen einzigen grossen Komplex 
  --> den “DNA-Replikatonsapparat“
• dieser Apparat ist wahrscheinlich während des Replikationsvorgangs nicht mobil sondern stationär
• jüngere Untersuchungen stützen ein Modell, nach dem der DNA-Replikationsapparat die DNA-Matrize wie ein Seil “einholt“ und am anderen Ende die replizierte DNA “ausstösst“

• es können sich die vielen Kopien des Apparates – vielleicht zusammengefasst zu “Fabriken“ – an der Kernmatrix  verankern, einem Fasergerüst, welches das gesamte Innere des Zellkerns zu durchziehen scheint

• Chromosomen von Prokaryoten sind ringförmig
• Eukaryoten besitzen lineare Chromosomen
• Problematik von linearen Chr.:
  1.) gleichen die Ende des linearen Chromosomen strukturell DNA Doppelstrangbrüche (zählen zu den gefährlichsten DNA Schäden überhaupt)
  2.) der Replikationsapparat hat Schwierigkeiten lineare DNA Moleküle zu Ende zu replizieren

Lösung: Telomere
(Wenn es nicht Mechanismen gäbe, die dies aktiv verhindern, würde die Zelle sofort versuchen, die vermeintlichen DNA Doppelstrangbrüche zu reparieren  und dabei einzelne Chromosomen miteinander zu verknüpfen.)

Da die DNA Synthese auf dem Leitstrang kontinuierlich erfolgt, können die DNA Polymerasen den Leitstrang in der Regel problemlos bis zum Ende synthetisieren.

Wenn sie das Chromosomenende erreicht haben, fallen sie wahrscheinlich einfach vom neu synthetisierten Strang ab.

• Die DNA Synthese auf dem Folgestrang verläuft diskontinuierlich und jedes Okazaki Fragment muss durch die Synthese eines Primers initiiert werden.
• Nähert sich die Replikationsgabel einem Chromosomenende, ist plötzlich kein Platz mehr vorhanden, den Primer für  ein neues Okazaki Fragment zu synthetisieren.
• Da alle DNA Polymerasen Nukleotide nur an das 3' Ende eines wachsenden Stranges anknüpfen können, nicht aber an das 5' Ende, verbleibt eine Lücke im Folgestrang am Ende eines linearen Chromosoms.

• die Enden linearer Chromosomen enthalten keine Gene; stattdessen besteht die DNA aus vielen Wiederholungen einer kurzen Nukleotid Sequenz = Telomere
• für menschliche Telomere typische Wiederholungseinheit ist TTAGGG
• Zahl der Wiederholungen in einem Telomer schwankt zwischen 100 und 1000

• Gewisse Proteine binden spezifisch an die Telomer-Sequenz und bewirken, dass sich das Ende der DNA Doppelhelix auf eine bestimmte Art faltet.
• Dadurch wird das DNA Ende "versteckt" und kann von der Zelle nicht mehr mit einem Doppelstrangbruch verwechselt werden.
• Damit hat die Zelle eines der Probleme linearer Chromosomen elegant gelöst

• die meisten Eukaryoten besitzen es
• ein spezielles Enzym, welches Telomere verlängern kann
• ist eine reverse Transkriptase (ähnlich derer von Retroviren)
  --> Telomerase kann also RNA in DNA "umschreiben"
• besteht aus einem Proteinteil + einem integrierten RNA Molekül
  --> Diese Kombination erlaubt ihm, kurze DNA Stücke ans freie 3' Ende des linearen Chromosoms anzuhängen,  wobei die RNA als Matrize dient --> Dadurch wird das 3' Ende des linearen Chromosoms verlängert und in der nächsten Replikationsrunde ist dann genügend Platz vorhanden, um ein zusätzliches Okazakifragment zu synthetisieren.
 • dank ihr können Eukaryoten die Länge ihrer Chromosomen stabil halten, auch nach vielen Replikationsrunden.

• die meisten ausdifferenzierten Zellen eines mehrzelligen Organismus haben das Gen - das für Telomerase kodiert, - inaktiviert
--> dadurch sind die meisten adulten somatischen Zellen (= nicht Keimzellen) auch nicht in der Lage, sich unbegrenzt  oft zu teilen
--> stossen an eine natürliche Grenze
--> nämlich dann, wenn ihre Telomere so kurz geworden sind, dass die Zelle beginnt, die Enden von Chromosomen als Doppelstrangbrüche zu erkennen
--> bedeutet dann meist das Ende der Zelle
--> hört auf sich zu teilen oder Apoptosis

--> Somit schützen lineare Chromosomen nicht unwesentlich vor unkontrolliertem Zellwachstum <--

Es gelingt leider vielen Krebszellen, die Inaktivierung des Telomerase Gens (führt dazu, dass Zellen sich unbegrenzt vermehren können) rückgängig zu machen, was ihnen dann nahezu unbeschränkte Lebensdauer verleiht.

1. Semikonservativer Prozess
2. Extrem genau
3. DNA Polymerasen, DNA Ligasen, Exonukleasen, Primasen, Helikasen Topoisomerasen und Einzelstrang bindende Proteine sind involviert
4. Polymerisationsrichtung ist immer 5‘→3‘
5. Semidiskontinuierlich (kontinuierlich auf dem Leistrang, diskontinuierlich auf dem Folgestrang)
6. RNA als Primer
7. Okazakifragmente auf dem Folgestrang
8. In jeder Replikationsrunde wird immer das ganze Genom genau einmal kopiert
9. Lineare Chromosomen brauchen spezielle Endreplikation
10. Replikation kann uni-direktional oder bi-direktional erfolgen

• Die DNA von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Mensch, ist ständig Aussenwelteinflüssen ausgesetzt, die chemische Veränderungen an der DNA erzeugen.
• Da die DNA eine hochreaktive chemische Substanz ist, stellt sie eine geeignete “Zielscheibe“ für viele chemische und physikalische Stoffe dar.

• Hitze --> die Desaminierung (Abspaltung von Ammoniak) von Basen und Depurinierung (eine Purinbase, das heißt entweder Adenin oder Guanin, wird vom Zucker-Phosphat-Gerüst des DNA-Doppelstrangs durch Hydrolyse abgespalten)
• Ultraviolette Strahlung --> produziert Thymindimere
• Ionisierende Strahlung --> Ringöffnung von Basen, Basenzerstörung, Einzel- und Doppelstrangbrüchen in der DNA-Kette

Die chemischen Stoffe, die die DNA modifizieren, sind sehr zahlreich: Sie reichen von Sauerstoffradikalen bis zu  diversen anorganischen und organischen elektrophilen Substanzen wie Metallionen, alkylierende Agentien und  polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe. Selbst ein gewöhnlicher Metabolit, wie Glukose, kann zur Veränderung der DNA führen.

• DNA weist während Jahrtausenden und Jahrmillionen eine sehr grosse Stabilität auf --> Reperaturmechanismen
• dies ist bekanntlich notwendig, um die genetische Information aufrechtzuerhalten
• Im Gegensatz dazu sind die beiden anderen Makromoleküle RNA und Proteine viel weniger stabil gegen  Veränderungen.

• Tiere und Menschen sind ständig zum schädlichen Agentien (Zigarettenrauch Benzpyrene, cis-Platin in Chemotherapie; ionisierenden Strahlen-Röntgen) ausgesetzt
• Auch Sonnen in Bergen und am Meer mithilfe von UV-Strahlen!

• Es gibt verschiedene Strategien die DNA zu reparieren.
• Dazu gehören die direkte Reparatur, Postreplikationsreparatur und die Rekombinationsreparatur.

• DNA Schaden wird direkt behoben
• die vorangegangene chemische Reaktion verläuft rückwärts
• die Reaktion kann nur geschehen wenn die Zelle über ein geeignetes Enzym verfügt

• Beispiel: O⁶-Methylguanin-DNA-methyltransferase kann Methylgruppen an der O⁶-Gruppe vom Guanin direkt entfernen
--> Das Enzym bindet die Methylgruppe an ein Cystein und inaktiviert sich irreversibel --> steht für keine weitere Reaktion mehr zur Verfügung

• Strategie: ein defektes Teilchen durch ein neues ersetzen
• Vorgehen: durch Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung zwischen der Desoxyribose und der Base wird die chemisch veränderte Base eliminiert --> Entfernung des Zuckers ohne Base --> DNA-Polymerase füllt die Lücke mit korrekter Base + Zucker
• BER benötigt fünf Enzyme:
  - DNA-Glykosylase
  - 5‘ AP-Endonuclease
  - 3‘ AP-Endonuclease oder 5‘à-->3‘ Exonuclease
  - DNA-Polymerase
  - DNA-Ligase