Genetik

=Abschluss der Repliaktion

-Prokaryoten: wenn Replikon am gegenüberliegenden Teil der Ori auf Terminationstellen trifft

-Eukaryoten: wenn 2 Replisome aufeinandertreffen, kommt es zur Disassemblierung der Replisomen und zur Ligation der neuen DNA-Enden

-Prokaryoten: können Origins vor erneuter Zellteilung, manchmal sogar vor Abschluss der ersten Replikationsrunde, mehrmals verwenden

-Eukaryoten: Origin vor der erneuten Zellteilung nicht mehrfach genutzt, um keinen Teil des Genoms zu überamplifizieren. Ausnahmen: Zellen mit mehr als einem diploiden Genom (=Genom wird pro Zellzyklus exakt einaml repliziert)

Zellzyklus  induziert die Replikation in der S-Phase über Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs), die beim Übergang von der G1- in die S-Phase ansteigt

-die Telomere der Chromosomen verkürzen sich mit jeder Replikationsrunde, weil der letzte Primer nicht ganz am Ende ansetzt

Telomere haben eine protektive Funktion-> bei zu wenig Telomer-DNA geht diese Funktion verloren-> Chromosomen-Enden werden instabil-> Zelltod

-die meisten sich teilenden Zellen zeigen Telomer-Verkürzungen mit zunehmendem Alter, muss nicht immer von Nachteil sein: Schutzfunktion vor unkontrollierter Krebszellwucherung

-Bei Stammzellen verlängert die Telomerase mithilfe einer RNA-Matrize die Telomere

-Telomerase wandert zum neuen Ende, die Lücken werden von der DNA-Polymerase aufgefüllt

-ermöglicht molekulare und funktionelle Untersuchung eines Gens und Eingriffe in die Natur

-hohes wissenschaftliches, gesellschaftliches und kommerzielles Potenzial

-genutzt werden gentechnisch veränderte Organismen um

  -genetische/zellbiologische Prozesse zu überwachen

  -rekombinante Proteine herzustellen

  -genetisch veränderte Nutzorganismen herzustellen

Ziel ist das efiiziente Arbeiten im Labor

-DNA-Vervielfältigung und stabiler Erhalt

-DNA-Veränderung: Neukombination vers. DNA-Stücken, induzierte Mutation der DNA-Sequenzen

-Einsatz genetisch veränderter Organismen: vervielfältigung und stabilen Erhalt der DNA, Erforschung zellbiologischer Prozesse, Herstellung rekombinanter Proteine zur biochemischen Untersuchung/Medikament, Herstellung genetisch veränderter Organismen zur komerziellen Nutzung

DNA-Sequenzbestimmung

-DNA-Isolation

-PCR zur DNA-Amplifikation

-Klonierung

-Übetragung der rekombinanten DNA in Wirtsorganismen: Transformation, Transfektion, Transduktion

-DNA-Sequenzierung

-Mutation

-Hybridisierung

1. Schneiden von DNA durch Restriktionsendonukleasen

2. Zusammenbringen verdauter DNA-Stücke

3. Transformation neu ligierten Plasmide in E. coli

4. Klutivierung mit Ampicillin zur Selektion gewünschter Plasmide/Bakterien

5. Isolierung der Plasmid-DNA

6. Restriktionsanalyse mittels Gelelektrophorese zur Überprüfung, ob die Bakterien das Plasmid tatsächlich enthalten/ob die Klonierung erfolgreich war

-Klonierung eines gewünschten DNA-Stücks

-Bestimmung der DNA-Sequenz durch DNA-Sequenzierung

-Nachweis einer bestimmten DNA

Punktmutation der DNA-Sequenz

-Quantifizierung von DNA

=eine Sammlung von DNA-Stücken des gleichen Organismus. Repräsentiert großen Teil der Gene einer Zelle/eines Organismus

-für eine Genbank wird ein ganzes Genom oder Teile davon isoliert und fragmentiert. Die Fragmente werden dann in Plasmide kloniert um sie vermehren zu können

-Eine Genbank kann dann sequenziert werden um die Sequenz ganzer Genome von Organismen bestimmen zu können

=enthalten alle exprimierten Gene einer Zellpopulation 

-alle mRNAs werden in DNA ungeschrieben und dann in Plasmide kloniert

-cDNAs enthalten den kodierenden Bereich eines Gens (Exons)

-sie sind zelltypspezifisch= spieglen unterschiedliche Zellfunktionen von Körperzellen wider

-und zustandsspezifisch= spiegeln unterschiedliche Zellzustände bzw. Rahmenbedingungen wider

- um Aussagen über das Expressionsprofil eines Gens treffen zu können 

-um ein zu untersuchendes eukaryotisches Gen in E. coli zu exprimieren

- um effizient mit einem eukaryotischen Gen arbeiten zu können

-Gentechnisch veränderte Organsimen bei denen das Genom durch genetische Methoden verändert wurde (ohne Einbringen von Fremdgenen)

-Transgene Organismen bei denen das Genom durch einbringen von Fremdgenen verändert wird (Klonierung)

=zur Untersuchung von Genfunktionen, also welche Rolle ein beliebiges Gen in einem Organismus ausübt

-Herstellung von Tiermodellen für Krankheiten

-Herstellung kommerzieller nutzbarer Organismen

-neue Genediting-Methode, effizienter als klassische homologe Rekombination

-kann in Zukunft viele Krankheiten in erwachsenen Menschen zu heilen und die vererbung genetischer Krankheiten an Kinder zu verhindern

allerdings ethisch moralische Bedenken:

-"Designermensch"

-Eingriffe in die Keimbahn sind tabu

=Zelle agiert vorbeugend und nachsorgend durch Fehlervermeidung und DNA-Reperatur

-Fehlervermeidung: Korrekturlesefunktion von Polymerasen und DNA Damage Response Checkpoints

-DNA-Reperatur: Exzisionsreparatur, Reperatur von Doppelstrangbrüchen

-DNA-Schaden= Veränderung der DNA-Struktur durch veränderung der chemischen Struktur und Einzel-/Doppelstrangbrüche

-Mutationen= DNA bleibt intakt, nur Sequenz wird verändert, sind irreversibel und vererbbar

-exogen: Chemikalien, Strahlung

-endogen: Stoffwechsel, Mismatches in der DNA-Replikation, DNA-Reperatur und andere Chromatin-Prozesse

Bei Mismatches kann sich die Identifizierung und die Reparatur von DNA-Schäden schwierig gestalten, da keine chemische Veränderung erkennbar ist und keine Information darüber vorliegt welche Base die falsche ist, bleibt die Reperatur aus

-Kleinere Veränderungen zB Punktmutationen, Deletion/Insertion von Basen

-Größere Veränderungen: Verlust/Gewinn ganzer Chromosomen, Chromosomentransitionen, Insertion, Deletion, Inversion, Duplikation großer Sequenzbereiche

-Promotorregion (Regulation der Genexpression): veränderte Genexpression, Über-/Unterangebot des entsprechenden Genprodukts

-Open Reading Frame (codierender Bereich des Gens): veränderte Funktion des Gens, Genprodukt mit veränderter Aktivität

-Telomere (schützen Enden): Verlust der Schutzfunktion-> Angriffspunkt für Exonuklease, Ligation mit anderen DNA-Stücken (Chromosomentransition)

-Centromer (Proteinkomplex): Verlust/Gewinn eines Centromers, Fehlverteilung der Chromosomen in der nächsten Mitose

=behebt Schäden und verhindert indirekt genetische Veränderungen/Mutationen

-DNA-Reparation ist essenziell weil die genetische Information stabil sein muss um

  1. einen hinreichend konstanten Phänotyp über die Generation zu gewährleisten

  2. Krankheiten wie krebs oder andere genetische Krankheiten zu verhindern

Sind sehr genaue Enzyme mit einer geringen Fehlerhäufigkeit

-verfügen daher über eine enzymatische Exonuklease-Aktivität, welche bei fehlpaarung das letzte Nukleotid entfernt und durch das korrekte ersetzt

=zelleigene Kontrollmechanismen, welche Duplikation und Segregation der Chromosomen (Replikation und Mitose) unter DNA-Damage-Bedingungen verhindern, denn

-Repliaktion unter DNA-Damage-Bedingungen führt zu: Mutatione, partiell unreplizierten Chromosomen, weiteren großen DNA-Veränderungen

-Mitose unter DNA-Damage-Bedingungen ist ebenfalls nachteilig für die Zelle: Chromosomenfehlverteilung

-M-Checkpoint in der Mitotischen Phase

-G1/G2-Checkpoint

-Blockieren der Zellzyklusprogression in der S-Phase oder Mitosephase nach DNA-Schäden verhindert das Kopieren und Segregieren der Chromosomen durch Inhibition der entsprechenden Cyclin-CDK-Aktivität

=Reparatur durch Ausschneiden des DNA-Schadens

Grundkonzept: Erkennen des Schaden-> Ausschneiden der Einzestrang-DNA-> Ersetzten des Einzelstrangs mithilfe des komplementären Stranges als Matrize

3 Pathways:

-Mismatch Repair bei Basenfehlpaarungen

-Base Excision Repair bei chemisch veränderten Basen, Depurinierung, T-G-Mismatches

-Nucleotide Excision Repair bei basenveränderungen, welche die Geometrie der DNA stark verzerren und dadurch die helikale Struktur der DNA stören

-DNA kann an beschädigten Stellen nicht repliziert werden

-replikative Polymerase bleibt stecken-> stattdessen wird Transläsions-Polymerase eingesetzt

-Neue Polymerase synthetisiert über den Fehler und macht viele Fehler

-nach erfolgreichem Passieren übernimmt die replikative Polymerase wieder

-können beide aus radioaktiver Strahlung entstehen

-Einzelstrangbrüche können sich zu Doppelstrangbrüchen entwickeln

-bei der Reperatur kann es zu Mutationen kommen

-es können nicht-zusammengehörige Chromosomenfragmente ligiert werden (Chromosomentransition)

-Induktion anderer Genomveränderungen (Duplikation, Inversion etc.)

1.Transkription=Information der DNA-Sequenz in eine entsprechende RNA-Sequenz umschreiben

2. Translation=RNA-Sequenz dient als Matrize um die Aminosäurensequenz eines Polypeptids zu erzeugen

erfordert einen Promoter der 

-der Polymerase den Starpunkt mitteilt

-über den Matrizenstrang informiert

-die Syntheserichtung vorgibt

erfolgt,

-in 5` zu 3` Richtung

-ohne Primer als Start

-unter partieller Denaturierung und Entwindung der DNA

-ohne Lesekorrektur

-in einem durchgehenden Stück (kontinuierlich)