Genetik

1.Initiation: Entwindung der Doppelhelix und Ausbildung der Replikationsgabel

2. Elongation: DNA-Synthese entlang der Replikationsgabel kontinuierlich am Leitstrang und diskontinuierlich am Folgestrang

3. Termination: bei Erreichen der Terminationstellen (Prokaryoten) und beim Aufeinandertreffen der Replikationsgabeln (Eukaryoten)

Synthesephase= Replikation der DNA

-Jedes Chromosom wird dupliziert und besteht danach aus 2 über Proteine miteinander verknüpften, 2 identischen Schwesterchromatiden

(-Schwesterchromatiden bleiben bis zur Mitose verbunden und werden in deren Verlauf zu Tochterchromosomen)

-Homöostase (Konstanz) der genetischen Informationen über die Zellgeneratio-> wird gewährleistet durch exaktes Kopieren der genetischen Information durch Replikation sowie deren exakte Verteilung in der Mitose

-DNA muss verdoppelt werden, bevor bei der Zellteilung jede Tochterzelle einen kompletten Gensatz enthalten kann

-Homöostase (Konstanz der genetischen Informationen über die Zellgenerationen)

-Fehler bei der Replikation können schwere Konsequenzen für zellen und Organismen haben: führen zu Veränderungen der genetischen Informationen (Basenabfolge) und können genetisch vererbbare Krankheiten oder Krebs hervorrufen

-Für den Erhalt der Homöostase muss die Replikation daher: vollständig sein (kein Teil des Genoms darf vergessen/mehrfach kopiert werden) und die DNA  ohne Fehler kopieren (Replikation muss ein exakter Prozess sein)

1. Bauanleitung für Genprodukte (Genexpression und Proteinbiosynthese)

2. Stabile Speicherung/Vererbung der genetischen Informationen (Replikation und Zellteilung=Homöostase der genetischen Informatioen)

1. Initiation: Beginn am Initiations-Ursprung (Origin) und Ausbildung von 2 Replikationsgabeln (Replisomen)

2. Elongation: Die aus einem Initiationsereignis entstandenen Replikationsgabeln wandern in entgegengesetzter Richtung (bi-direktional)

3. Termination: 

  -Prokaryoten: wenn Replikon am gegenüberliegenden Teil der Ori auf Terminationsstelle trifft

  -Eukaryoten: wenn 2 Replisomen aufeinandertreffen, kommt es zur Disassemblierung der Replisomen und zur Ligation der neuen DNA-Enden

=komplexe molekulare DNA.Kopiermaschinen aus vielen Komponenten, welche die Doppelstrang-DNA aufschmelzen und die Synthese vornehmen

-replikative Helikasen: Entspiralisierung der Doppelhelix durch Aufschmelzen der WSSB

-DNA-Polymerasen: führen Synthese der neuen Einzelstrang-DNA durch, benötigt ein freies 3`OH-Ende, hat eine Korrekturlesefunktion

-Primasen (RNA-Polymerasen) initiieren die Replikation: benötigt kein freies 3`OH-Ende, können deshalb einen RNA-Primer synthetisieren an den die DNA-Polymerasen anknüpfen

=Startpunkt der Replikation

-Beginnt an def. Stellen (Origin/Replikationsursprung)

1. Denaturierung (Aufschmelzen) des Doppelstrangs: Helikasen schmelzen die dsDNA unter ATP-Verbrauch in ssDNA indem WSSB aufgelöst werden

2. Entwindung: Topoisomerasen lösen Windungen der DNA auf damit Helikase weiterarbeiten kann, Einzelstrangbindende Proteine halten Matrizenstränge auseinander und machen sie so für die Primase und DNA-Polymerase II zugänglich

3. Anlagerung eines RNA-Primers: Primase synthetisiert kurzes RNA-Stück Primer), welches im Verlauf als Startsignal für die Repliaktion fungiert

=Synthese der Einzelstränge

-DNA-Synthese durch DNA-Polymerase III: beginnt am ende des 3`-Primers mit Kettenverlängerung indem schrittweise die komplementären Basen angeheftet werden, Polymerase nutzt hierzu die alten Stränge als Matrize und arbeitet von 5`- zu 3`-Richtung 

-Die Polymerase enthält eine Korrekturlesefunktion

=Abschluss der Repliaktion

-Prokaryoten: wenn Replikon am gegenüberliegenden Teil der Ori auf Terminationstellen trifft

-Eukaryoten: wenn 2 Replisome aufeinandertreffen, kommt es zur Disassemblierung der Replisomen und zur Ligation der neuen DNA-Enden

-Prokaryoten: können Origins vor erneuter Zellteilung, manchmal sogar vor Abschluss der ersten Replikationsrunde, mehrmals verwenden

-Eukaryoten: Origin vor der erneuten Zellteilung nicht mehrfach genutzt, um keinen Teil des Genoms zu überamplifizieren. Ausnahmen: Zellen mit mehr als einem diploiden Genom (=Genom wird pro Zellzyklus exakt einaml repliziert)

Zellzyklus  induziert die Replikation in der S-Phase über Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs), die beim Übergang von der G1- in die S-Phase ansteigt

-die Telomere der Chromosomen verkürzen sich mit jeder Replikationsrunde, weil der letzte Primer nicht ganz am Ende ansetzt

Telomere haben eine protektive Funktion-> bei zu wenig Telomer-DNA geht diese Funktion verloren-> Chromosomen-Enden werden instabil-> Zelltod

-die meisten sich teilenden Zellen zeigen Telomer-Verkürzungen mit zunehmendem Alter, muss nicht immer von Nachteil sein: Schutzfunktion vor unkontrollierter Krebszellwucherung

-Bei Stammzellen verlängert die Telomerase mithilfe einer RNA-Matrize die Telomere

-Telomerase wandert zum neuen Ende, die Lücken werden von der DNA-Polymerase aufgefüllt

-ermöglicht molekulare und funktionelle Untersuchung eines Gens und Eingriffe in die Natur

-hohes wissenschaftliches, gesellschaftliches und kommerzielles Potenzial

-genutzt werden gentechnisch veränderte Organismen um

  -genetische/zellbiologische Prozesse zu überwachen

  -rekombinante Proteine herzustellen

  -genetisch veränderte Nutzorganismen herzustellen

Ziel ist das efiiziente Arbeiten im Labor

-DNA-Vervielfältigung und stabiler Erhalt

-DNA-Veränderung: Neukombination vers. DNA-Stücken, induzierte Mutation der DNA-Sequenzen

-Einsatz genetisch veränderter Organismen: vervielfältigung und stabilen Erhalt der DNA, Erforschung zellbiologischer Prozesse, Herstellung rekombinanter Proteine zur biochemischen Untersuchung/Medikament, Herstellung genetisch veränderter Organismen zur komerziellen Nutzung

DNA-Sequenzbestimmung

-DNA-Isolation

-PCR zur DNA-Amplifikation

-Klonierung

-Übetragung der rekombinanten DNA in Wirtsorganismen: Transformation, Transfektion, Transduktion

-DNA-Sequenzierung

-Mutation

-Hybridisierung

1. Schneiden von DNA durch Restriktionsendonukleasen

2. Zusammenbringen verdauter DNA-Stücke

3. Transformation neu ligierten Plasmide in E. coli

4. Klutivierung mit Ampicillin zur Selektion gewünschter Plasmide/Bakterien

5. Isolierung der Plasmid-DNA

6. Restriktionsanalyse mittels Gelelektrophorese zur Überprüfung, ob die Bakterien das Plasmid tatsächlich enthalten/ob die Klonierung erfolgreich war

-Klonierung eines gewünschten DNA-Stücks

-Bestimmung der DNA-Sequenz durch DNA-Sequenzierung

-Nachweis einer bestimmten DNA

Punktmutation der DNA-Sequenz

-Quantifizierung von DNA

=eine Sammlung von DNA-Stücken des gleichen Organismus. Repräsentiert großen Teil der Gene einer Zelle/eines Organismus

-für eine Genbank wird ein ganzes Genom oder Teile davon isoliert und fragmentiert. Die Fragmente werden dann in Plasmide kloniert um sie vermehren zu können

-Eine Genbank kann dann sequenziert werden um die Sequenz ganzer Genome von Organismen bestimmen zu können

=enthalten alle exprimierten Gene einer Zellpopulation 

-alle mRNAs werden in DNA ungeschrieben und dann in Plasmide kloniert

-cDNAs enthalten den kodierenden Bereich eines Gens (Exons)

-sie sind zelltypspezifisch= spieglen unterschiedliche Zellfunktionen von Körperzellen wider

-und zustandsspezifisch= spiegeln unterschiedliche Zellzustände bzw. Rahmenbedingungen wider

- um Aussagen über das Expressionsprofil eines Gens treffen zu können 

-um ein zu untersuchendes eukaryotisches Gen in E. coli zu exprimieren

- um effizient mit einem eukaryotischen Gen arbeiten zu können

-Gentechnisch veränderte Organsimen bei denen das Genom durch genetische Methoden verändert wurde (ohne Einbringen von Fremdgenen)

-Transgene Organismen bei denen das Genom durch einbringen von Fremdgenen verändert wird (Klonierung)

=zur Untersuchung von Genfunktionen, also welche Rolle ein beliebiges Gen in einem Organismus ausübt

-Herstellung von Tiermodellen für Krankheiten

-Herstellung kommerzieller nutzbarer Organismen

-neue Genediting-Methode, effizienter als klassische homologe Rekombination

-kann in Zukunft viele Krankheiten in erwachsenen Menschen zu heilen und die vererbung genetischer Krankheiten an Kinder zu verhindern

allerdings ethisch moralische Bedenken:

-"Designermensch"

-Eingriffe in die Keimbahn sind tabu

=Zelle agiert vorbeugend und nachsorgend durch Fehlervermeidung und DNA-Reperatur

-Fehlervermeidung: Korrekturlesefunktion von Polymerasen und DNA Damage Response Checkpoints

-DNA-Reperatur: Exzisionsreparatur, Reperatur von Doppelstrangbrüchen

-DNA-Schaden= Veränderung der DNA-Struktur durch veränderung der chemischen Struktur und Einzel-/Doppelstrangbrüche

-Mutationen= DNA bleibt intakt, nur Sequenz wird verändert, sind irreversibel und vererbbar

-exogen: Chemikalien, Strahlung

-endogen: Stoffwechsel, Mismatches in der DNA-Replikation, DNA-Reperatur und andere Chromatin-Prozesse

Bei Mismatches kann sich die Identifizierung und die Reparatur von DNA-Schäden schwierig gestalten, da keine chemische Veränderung erkennbar ist und keine Information darüber vorliegt welche Base die falsche ist, bleibt die Reperatur aus

-Kleinere Veränderungen zB Punktmutationen, Deletion/Insertion von Basen

-Größere Veränderungen: Verlust/Gewinn ganzer Chromosomen, Chromosomentransitionen, Insertion, Deletion, Inversion, Duplikation großer Sequenzbereiche

-Promotorregion (Regulation der Genexpression): veränderte Genexpression, Über-/Unterangebot des entsprechenden Genprodukts

-Open Reading Frame (codierender Bereich des Gens): veränderte Funktion des Gens, Genprodukt mit veränderter Aktivität

-Telomere (schützen Enden): Verlust der Schutzfunktion-> Angriffspunkt für Exonuklease, Ligation mit anderen DNA-Stücken (Chromosomentransition)

-Centromer (Proteinkomplex): Verlust/Gewinn eines Centromers, Fehlverteilung der Chromosomen in der nächsten Mitose

=behebt Schäden und verhindert indirekt genetische Veränderungen/Mutationen

-DNA-Reparation ist essenziell weil die genetische Information stabil sein muss um

  1. einen hinreichend konstanten Phänotyp über die Generation zu gewährleisten

  2. Krankheiten wie krebs oder andere genetische Krankheiten zu verhindern

Sind sehr genaue Enzyme mit einer geringen Fehlerhäufigkeit

-verfügen daher über eine enzymatische Exonuklease-Aktivität, welche bei fehlpaarung das letzte Nukleotid entfernt und durch das korrekte ersetzt

=zelleigene Kontrollmechanismen, welche Duplikation und Segregation der Chromosomen (Replikation und Mitose) unter DNA-Damage-Bedingungen verhindern, denn

-Repliaktion unter DNA-Damage-Bedingungen führt zu: Mutatione, partiell unreplizierten Chromosomen, weiteren großen DNA-Veränderungen

-Mitose unter DNA-Damage-Bedingungen ist ebenfalls nachteilig für die Zelle: Chromosomenfehlverteilung