Immunhämatologie

Erythrozyten sind von einer festen positiv- und negativ-geladenen Elektronenwolke umgeben (elektrostatische Barriere). Die Summe der Ladungen wird auch als Zeta-Potential bezeichnet. IgG Antikörper prallen im ersten Moment an dieser ab. Trotzdem gelingt es den Antikörpern nach einer gewissen Zeit (30-60min) an das korrespondierende Antigen zu binden.

Um die Bindung der Antikörper im Labor zu beschleunigen wurde die LISS Lösung eingeführt. LISS bedeutet low ionic strength solution zu deutsch niedrig geladene Stärkelösung. Die LISS Lösung führt zu einem Aufquellen der Erythrozyten, dadurch werden die Antigene besser präsentiert und ein herabsetzen des Zeta-Potentials.
Durch die Verwendung der LISS Lösung kann die Bindung von inkompletten IgG Antikörpern innerhalb
von 15 Minuten statt finden (anstelle von 30-60 Minuten).

Ist zur Vermeidung von Probenverwechslungen und hämolytischen Transfusionsreaktion durchgeführt = Patientensicherheit.

Type: AB0/D Blutgruppen-Bestimmung resp. AB/D-Kontrolle der Patientenerythrozyten.

AB/D-Kontrolle der Spendererythrozyten (des Erythrozytenkonzentrats)

Screen: Antikörpersuchtest zum Nachweis von möglichen irregulären antierythrozytären Antikörpern im Serum/Plasma des Patienten.

CAVE: eventuell muss zusätzlich ein Rhesus-/K-Phänotyp und oder direkter Antihumanglobulintest bestimmt werden.

-Ist die Blutgruppe nicht bekannt, muss prätransfusionell die vollständige AB0/D-Bestimmung inkl. Serumgegenprobe (Isoagglutinine) an zwei unabhängig voneinander entnommenen Blutproben durchgeführt werden.

-Liegt eine vollständige AB0/D-Bestimmung vor, muss eine zweite vollständige Blutgruppenbestimmung (inkl. Serumgegenprobe) durchgeführt werden.

-Ist eine Patientin ein Patient bereits mit zwei vollständigen Blutgruppenbestimmungen bekannt und dokumentiert, genügt bei jeder weiteren Blutentnahme eine AB/D-Kontrolle. Daher ab der dritten und jeder weiteren Blutprobe wird nur eine AB/D-Kontrollbestimmung durchgeführt.

-Für die Kontrolle der ABD-Antigene genügt eine Bestimmung mit einem Anti-A, Anti-B und Anti-D Testserum (Antikörper)

-Die Resultate müssen mit der dokumentierten vollständigen Blutgruppenbestimmung übereinstimmen.

-Bei abweichendem oder fraglichen Resultat muss eine vollständige Blutgruppenbestimmung mit einer neuen Blutprobe erfolgen.

Positive Reaktionen der AB- und D- Antigene müssen eine 3+ oder 4+ Reaktion aufweisen. Abweichende Resultate müssen weiter abgeklärt werden. Bei der AB0/D-Bestimmung muss zusätzlich die Kontroll-Küvette (ctl.) negativ sein. Falls die KontrollKüvette eine positive Reaktion (+/- bis 4+) zeigt, ist die Blutgruppenbestimmung nicht gültig und weitere Untersuchungen und Test müssen durchgeführt werden.

Isoagglutinine gelten als Nachgewiesen, wenn mindestens eine ± oder 1+ Reaktion in der Mikroküvette vorliegt. Bei negativen Reaktionen müssen weitere Tests / Abklärungen vorgenommen werden. Ergebnisse mit der Testzelle 0 müssen immer negativ ausfallen. Bei positiven Reaktionen müssen weitere Abklärungen vorgenommen werden. Stimmen die Isoagglutinine nicht mit der Blutgruppe überein, darf die Blutgruppe gesamthaft nicht interpretiert werden. Die Diskrepanz muss weiter Abgeklärt werden.

-Mindestens A1, B und 0 Testerythrozyten (A2 ist nicht obligatorisch)

-Wird mit dem Serum/Plasma des Patienten durchgeführt.

-Antigen- und Isoagglutininbestimmung muss übereinstimmen

-Treten abweichende oder fragliche Resultate auf, darf die Blutgruppe nicht interpretiert werden. Es müssen weitere Abklärungen folgen.

Bei folgenden Personengruppen muss der Rhesus-/K-Phänotyp bestimmt werden:

– Frauen unter 50 Jahre

– Irreguläre Antikörper

– Chronische Transfusionsbedürftigkeit

Als minimale Anforderung vor Transfusion soll die Rhesus-/K-Phänotyp-Bestimmung einmal durchgeführt werden.

Im Regelfall wird eine Rhesus-/K-Phänotyp-Bestimmung bei obengenannten Personen aus zwei unabhängig entnommenen Blutproben durchgeführt.

Positive Reaktionen der Rhesus- und Kell- Antigene müssen eine 3+ bis 4+ Reaktion aufweisen. Reaktionen <3+ müssen weiter Abgeklärt werden.

Die Kontrollküvette muss negativ sein. Ist die Kontrollküvette positiv oder treten abweichende oder fragliche Reaktionen auf, ist die Rhesus-/K-Phänotyp-Bestimmung ungültig und darf nicht interpretiert werden. Weitere Abklärungen müssen folgen.

Bei allen Blutproben wird zusätzlich zur Blutgruppen-Bestimmung einen Antikörpersuchtest durchgeführt. Der Antikörpersuchtest wird mittels indirektem Antihumanglobulintest in der LISS/Coombs Gelkarte durchgeführt.

Der AKST ist ein einfacher Test um im Serum des Patienten nach irregulären AK zu suchen (=screen).

Dabei werden Hergestellte Testzellen verwendet von denen das Antigenmuster ist. Die Auswahl der Testzellen erfolgt auf der Grundlage der Gesetzgebung /STVM Empfehlung.

-Eventuell vorhandene erythrozytären Alloantikörper werden mittels Antikörpersuchtest im Serum/Plasma nachgewiesen.

-Falls der Antikörpersichtest positiv ist, wird eine Identifizierung der erythrozytären Alloantikörper durchgeführt.

-Der Antikörpersuchtest muss mindestens wärmeaktive Alloantikörper der IgG-Klasse erfassen.

-Der Antikörpersichtest wird mittels indirektem Antihumanglobulintest (IAT) durchgeführt (Gel oder Röhrchenmethode)

Wird der Antikörpersuchtest (AKST) negativ, können keine transfusionsrelevanten Antikörper nachgewiesen werden.

Positive Reaktionen (+/- bis 4+) mit mind. einer Testzelle weisen auf das Vorhandensein von transfusionsrelevanten Antikörpern hin und müssen weiter Abgeklärt werden.

Bei positiven Ergebnissen des AKST muss zwingend eine Antikörperspezifizierung folgen.

Die verwendeten Methoden zur Antikörperspezifizierung müssen wärmeaktive, inkomplette, antierythrozytäre Antikörper erfassen.

Der sogenannte Panel wird im indirekten Antihumangolbulintest (IAT) und Enzymtest angesetzt.

Ausgangslage:

– Rhesus D negative Mutter

– Rhesus D positives erstes Kind

– Während der Schwangerschaft oder bei Geburt kommt die Mutter mit Rhesus D positiven Erythrozyten in Kontakt

– Wir wissen Rhesus D ist hoch immunogen

– Die Frau bildet meist nach der ersten Schwangerschaft Antikörper gegen Rhesus D

– Bei der zweiten Schwangerschaft mit einem Rhesus D positiven Kind, treten die Rhesus D Antikörper (IgG) via Nabelschnur zum Fötus und Hämolysieren die Kindlichen Erythrozyten.

Was kann gegen einen MHN aufgrund des Rhesus D Antigens unternommen werden?

Der Rhesus D negativen Frau, werden während und nach der Schwangerschaft eine geringe Menge an Rhesus D Antikörpern gespritzt. Diese Antikörper fangen Rhesus D positive Erythrozyten während und nach der Schwangerschaft ab und verhindern, dass das Immunsystem mit dem Rhesus D Antigen in Kontakt kommen.

Dies verhindert zu 99%, dass Rhesus D Antikörper gebildet werden.

Die Vorgaben für das Qualitätsmanagement in der Immunhämatologie gibt der Gesetzgerber und Swissmedic vor.

– Aufbewahrungspflicht Alle wichtigen Dokumente müssen (seit 2020) für 30 Jahre aufbewahrt werden. Was heisst wichtig: Vom Spender zum Patienten und umgekehrt inkl. Alle Arbeitsanweisungen und Protokolle der Qualitätskontrollen

– Vorgaben der Reagenzien (Testzellen und Testseren) werden gesetzlich bestimmt und finden sich in den «Empfehlungen» der SVTM

– Qualitätskontrollen Vorgaben nach STVM Grundregel jede Methode und Antigen mind. 1x pro 24h oder bei Testdurchführung

-Transfusionen innerhalb der letzten 14 Tage

-Hämolysezeichen

-Transfusionsreaktion

-Verdacht auf Autoimmunhämolyse

-Verdacht auf MHN

1. und 2. Bestimmung Erwachsene:

-Vollständige Blutgruppenbestimmung (AB0/D + Isoagglutinine) + Antikörpersuchtest

Bei Frauen unter 50: Rhesus-/Kell-Phänotyp Bestimmung

Ab der 3. Bestimmung

-ABD-Kontrolle + Antikörpersuchtest

Type & Screen Gültigkeit 96h (4 Tage) ab dem Zeitpunkt der Blutentnahme.

Sobald alle Tests abgeschlossen sind, dürfen Transfusionen durchgeführt werden.

Für die Bestimmung des Rh-D-Antigens sollen zwei unterschiedliche Ant-D-Antikörper, die von verschiedenen Klonen stammen, verwendet werden.

Mindestens ein Anti-D-Antikörper muss die Variante RHD*DVI erfassen.

Mindestens ein Anti-D-Antikörper darf die Variante RHD*DVI nicht erfassen.

Verschiedene Rhesus-D Untergruppen

Eine davon Rh-D Partial Vl

Möglichkeit einer Bildung von irregulären Allo-Anti-D

-Die Rhesus-/Kell-Phänotyp Bestimmung umfasst die Antigene: C, c, E, e und K.

-Die minimale Anforderung ist eine Bestimmung mit den entsprechenden Testseren mit einer Methode

-Die Resultate müssen eindeutig positiv oder negativ sein.

-Treten abweichende oder fragliche Resultate auf, dürfen die Blutgruppenantigene nicht interpretiert werden. Es müssen weitere Abklärungen erfolgen.

-Testerythrozyten der Blutgruppe 0 mit bekannter Antigenmuster und Serum/Plasma des Patienten mit Antikörpern der IgG-Klasse werden in die Mikroküvette pipettiert.

-Inkubation: Vorhandene Antikörper im Serum/Plasma binden mit den korrespondierenden Antigenen der Testerythrozyten.

-Ec mit gebundenen IgG alleine erzeigen keine sichtbare Agglutination.

-Zentrifugation: Durch die Zentrifugation, werden die EC durch den Gel gedrückt. Freie Antikörper und Plasmaproteine verbleiben oberhalb des Gels.

-Konnten Antikörper an die EC binden, werden diese vom AHG abgefangen und bilden sichtbare Agglutinationen.

-Positive Reaktionen=Antigen und Antikörper konnten binden und wurden vom AHG und der Gelmatrix abgefangen.

-Negative Reaktion=Keine Verbindung zwischen Antikörper und Antigen (keinen Antikörper gegen Blutgruppenantigen), EC wandern durch den Gel.

-Serum/Plasma mit Plasmaproteine, Antikörper, EC

-Testerythrozyten beifügen und Inkubieren

-Keine Gelmatrix = 3x Waschen mit NaCl, sonst stören Plasmaproteine und freie Antikörper

-nur EC mit Antikörper

-AHG beigeben

-Zentrifugieren -> Agglutination

-Ablesen unter warmlicht

Neugeborenen haben keine Isoagglutinine, da der Immunsystem noch im Aufbau ist, Isoagglutinine durch Kontakt gebildet werden und Isoagglutinine treten ab dem 3 Lebensmonat auf kann bis 12 Monate benötigen.

Die vollständige Blutgruppenbestimmung bei Neugeborenen ist nicht möglich nur Vorläufig, da keine Serumgegenprobe möglich.

Blut: Kapilläres/venöses oder Nabelschnurblut

1. und 2. Blutgruppenbestimmung wird mit je zwei verschiedenen Testseren (in einem doppelten Ansatz mit mindestens je einem unterschiedlichen Klon) durchführt.

Fast immer wird  bei Neugeborebeb einen DAT verlangt, weil man wissen will, ob das Kind Morbus hämolyticus neonatorum (MHN) hat.

Durch einen MHN hat das Neugeborene beladene EC, Diese werden im DAT erfasst.

-AHG wird benötigt.

-EC-Suspension des Patienten werden in die Reaktionskammer pipettiert. Die EC sind in diesem Fall bereits beladen.

-Keine Inkubation kein LISS nötig, da die Bindung schon im Patienten stattgefunden hat.

-Zentrifugation: Durch die Zentrifugation, werden die EC in und durch den Gel gedrückt.

-Negative Reaktion=Es kann keine IgG-Beladung der EC nachgewiesen werden.

-Positive Reaktion= Jegliche posititve Reaktion wird als posititv beurteilt (+ - 4+). Die Agglutination weisst auf eine in vivo Beladung der EC mit IgG. Um eine differenzeiertere Aussage der Beladung machen zu können oder um eine Beladung mit IgM, IgA oder C3c nachzuweisen, muss ein Monospezifischer DAT angesetzt werden.

Ein positiver DAT sagt nur aus, dass in vivo Antikörper (oder Komplement) an die EC fixiert wurden. (Um herauszufinden, ob es sich um transfusionsrelevante Antikörper handelt oder nur durch Medikamente verursachte Komplemet Aktivierung muss eine Elution durchgeführt werden.)

-Im Röhrchen sind EC, Antikörper, Plasmaproteine

-3x Waschen mit NaCl nur EC bleiben

-AHG dazugeben

1 Fall: keine Agglutination, AHG + EC sind frei =DAT neg.

2 Fall: AHG + beladene EC binden sich und es entsteht eine Agglutination =Dat pos.

3 Fall: Waschen hat nicht gereicht es hat immernoch Antikörper (ich weiss es aber nicht) AHG binden mit Antikörper =DAT Falsch neg. (ich weiss es aber nicht)

Aus diesem Grund müssen alle negative Resultate müssen mit der Coombs-Kontrolle(Fläschchen mit EC die beladen sind) kontrolliert werden.

Daher Korrekt neg. + Kontrolle = pos. (Test und Waschen korrekt)

Falsch neg. + Kontrolle = neg. (Test und Waschen nicht korrekt)

 Nutzen/Anwendung:

-Angebrochener Beutel muss aufgebraucht werden ausser bei Unverträglichkeiten.

-Inhalt des Beutels muss vor jeder Transfusion durchmischt werden.

-Keine venöse Zugänge mit anderen Substanzen (z.B. Medis, Albumin, Ca)

Indikation:

-Aufgrund klinischer Beurteilung

-Bei plötzlichem Blutverlust, (Um Sauerstofftransport sicherzustellen)

-Bei Blutanämien

-Bei Leukämie

Lagerung und Haltbarkeit:

-1x erwärmtes EC-Konzentrat sollte nicht wieder gelagert werden.

-Haltbarkeit: 42-49 Tage

-Temperatur: 2-6 Grad

Volumen und Inhalt:

-EC

-Stabilisator & Antikoagulanzlösung

-Adaptive Lösung

-Gesamtvolumen 200-350ml

Gesplitterte EC-Konzentrate:

-In mehrere Beutel: 2-fach Beutel und 4 -fach Beutel, (z.B. kleineres Volumen nötig für Babys, angebrochener Beutel muss entsorgt werden.

Besonderheit in der Herstellung:

-Mittels Erythrozytapherese maschinell direkt am Spender gewonnen.

-Auftrennung des gespendeten Vollblutes mittels Zentrifugation

-> in EC und zellfreies Blutplasma

->übriggebliebene EC werden mittels Stabilisatorlösung aufgeschwemmt und mittels zusätzlicher Filterung werden LC entfernt. Es können nie alle LC abgefiltert werden.

 Anwendung:

-Es wird transfundiert bei Patienten mit ausgeprägten Mangel an TC. Es sorgt dass, das Blut innerhalb der Blutgefässe bleibt.

Indikationen:

-Mangel an TC

-Schlechte Blutgerinnung

Lagerung und Haltbarkeit:

-In Suspension von Plasma (32-47%) und additiver Lösung.

-Lagerung erfolgt bei 22 Grad unter ständiger Agitation.

-7 Tage haltbar

Volumen und Inhalt:

-200-400ml

-TC welche in einer Suspension gelagert sind

-Stabilisatorlösung

-Ernährungslösung

Gesplitterte TK:

-Für Kleinkinder.

Herstellung:

-Aus vier verschiedenen Vollblutspenden mit gleichem Rh-D

-Durch Thrombozytapherese bei einem Einzelspender hergestellt

-Rhesus D berücksichtigen, da es Immunogen ist

Inhalt:

-Wasser + Elektrolyte

-Proteine wie Albumin, Immunoglobuline, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren

-Hilfstoffe

Volumen:

-180-330ml Vollblut

Anwendung:

-unmittelbar vor Gebrauch im Wasserbad für 20 min bei 37 Grad auftauen, vorsichtig schwenken

-pro kg= 10-15ml

Indikation:

-Ersatz für Gerinnungsfaktoren (Leberinsuffizienz)

-Plasma-Ersatz bei starken Blutverlust

-Flussigkeitshaushalt sinkt

Lagerung & Haltbarkeit:

-bei -25 Grad für ca. 2 Jahre

-4 Monate nach Entnahme Quarantäne-Lagerung

Besonderheiten

-Kaum Zellanteil im FFP

-für Schwangere nur im Notfall geeignet

-zu hohe Menge + zu schnelle Gabe =Hypocalciämie

-nie verwenden bei kaputten Schutzbeutel

-nach Transfusion 30 min klinische Überwachung

Warum Bestrahlung?

-Durch die Bestrahlung wird die Übertragung Immunkompetenter Zellen des Spenders auf den Empfänger vermindert.

Was Passiert Bei Der Bestrahlung?

-Lebende DNA-Zellen & Leukozyten Werden Abgetötet

-Röntgenstrahlung oder Radioaktive Strahlung

-25-50 Gy Bestrahlung

-Bestrahlung Für Den Menschlichen Körper Tödlich

Wann wird es Eingesetzt?

-Zum Ersatz Fehlender Erythrozyten Bei Akuter Oder / Chronischer Anämien

-Bei Patienten mit Einer Immunschwäche:

-Immunsupprimierten

-Frühgeborenen

-Knochenmarktransplantierten

Vorteile?

-Verminderung Graft-Versus-Host-Reaktion (Zytotoxische Reaktion)

-Für Organempfangende PERSON LEBENSBEDROHLICH 

-Inaktivierung von Pathogenen in Blutspenderkonserven, verhindert Transkription DNA-Vermehrung, keine 100% Elimination möglich.

-Wird bei TK & Transfusionsplasma verwendet.

-Wird eingesetzt, damit Krankheiten von Spender zu Empfänger bei Transfusion nicht übertragen werden.

-Bei TK: Zugabe Amotosale-HCL & Bestrahlung UVA-Licht, überschüssige Amotosale wird im Anschluss entfernt.

 -Als minimale Anforderung soll die Rhesus-/K-Phänotyp-Bestimmung einmal durchgeführt werden. 

-nicht angeschriebenen oder nicht zuzuordnenden Blutproben dürfen keine prätransfusionellen Untersuchungen durchgeführt werden.

-Ob jemand Blutgruppe A1 oder A2 hat ist nicht transfusionsrelevant.

-Die wichtigste Blutgruppe ist die 0.

-Kühl lagern

-nur Blut gegeben werden, welches auch vertragen wird.

-nach der Transfusion 30min Patient zur Behandlung behalten.

-Der Antikörpersuchtest wird in der LISS/Coombs Gelkarte angesetzt.

-Die Gelkarte wird unmissverständlich Beschriftet.

-Die Alufolie wird für die benötigten Mikroküvetten abgezogen.

-Als erstes werden die Testec pipettiert.

-Danach wird in jede Mikroküvette das Serum pipettiert.

-Bevor zentrifugiert werden darf, muss eine Inkubation stattfinden -> 37 Grad(Reaktionsoptimum IgG) für 15 min

-Zentrifugation

-Ablesen

-Protokollieren

• Doppelpopulation (oben und unten sedimentierte EC):

Ursachen:

-AB0-Kompatibel Transfusion

-Allogene Knochenmarktransplantation

-Nabelschnurblut: Mischung der ungleichen kindlichen und mütterlichen EC

Massnahmen:

-Transfusionhistorie: intern oder in einem anderen Spital:

Bei Menschen wo man sich nicht sicher ist (Diskrepanz Ec Sediment oben und unten), gibt man Blutgruppe 0 und man sagt man akzeptiert die Blutgruppenbestimmung nicht, Pat. soll nach 3 Monat nochmals kommen (Ec leben 120 Tage) und nochmals testen.

-Stammzelltransplantation: Nachfrage bei Arzt oder Transplantationszentrum

-Nabelschurblut: Fersenblut anfordern

• Positive Kontrolle (Kontrolle muss immer negativ sein):

Ursachen:

-starke Paraproteinämie

-starke Kälteantikörper

-Nabelschnurblut kann vermischt mit der Warton’schen Sulze sein

-Verschleppung der Reagenzien

Massnahmen:

-Mehrmaliges Auswachen der EC mit NaCl

-Mehrmaliges Auswaschen der EC mit warmen NaCl

-Fersenblut Anfordern

-Ansatz wiederholen

• Abgeschwächte Antigene (wenn die Reaktionsstärke kleiner als 3+ ist)

Ursachen:

-A-Untergruppe

-Neugeborene

-Leukämie, MDS

Massnahmen:

-Untergruppe serologisch oder molekulargenetisch Nachweisen.

-Bei Neugeborenen und Kindern <4 Monate dürfen abgeschwächte die Reaktionen bei A und B akzeptiert werden.

-Bestimmung mit anderen Testseren (Antikörper-Klone) wiederholen.

Ursache:

-Neugeborene: frühstens nach 3 Monate spätestens nach 12 Monaten Nachweisbar

-Alter

-Agammaglobulinämie

Massnahmen:

-Ansatz bei 4 Grad und /oder mit doppelter Serummenge

-Wiederholung der AB0-Bestimmung mit anderem Testseren (Antikörper-Klon)

-Molekulargenetische Bestimmung