Immunhämatologie
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Hauptaufgaben der Immunhämatologie
-Erkennung und die Bestimmung von Antigenen auf der Erythrozytenoberfläch:
dazu werden Antikörper benutzt deren Spezifität bekannt ist.
-Identifikation und Spezifizierung von Antikörpern im Blutplasma, die gegen Erythrozytenoberflächenantigene gerichtet sind:
dazu werden Erythrozyten benutzt deren Antigene bekannt sind.
Meistens werden serologische Nachweisverfahren benutzt.
Hämagglutination
Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, das Antikörper eine Verbindung mit dem korresponideren Antigen eingeht. -> Schlüssel-Schloss-Prinzip
Antigene
Substanzen die in der Lage sind,
-in einem Fremdorganismus eine Immunantwort auszulösen
-mit vorgebildetetn Antikörpern oder sensibilisierten Lyphozyten zu reagieren bzw. zu binden.
In der Immunhämatologie:
-Zellstädnig
-Auf der Oberfläche nachweisbar
-Mehr oder weniger starke Fähigkeit eine Antikörperbildung auszulösen (Immunnogenität)
-Fähigkeit mit Antikörpern eine Bindung einzugehen (Antigenität)
-Bestehen vor allem aus Proteinen oder Kohlenhydrate
Epitope
Epitope sind bestimmte Areal an der Oberfläche eines Antigen. Die Epitope eines Antigens unterscheiden sich von den Epitopen anderer Antigene. Epitope sind die Bindungsstellen der Antikörper.
Ein Antigen kann somit verschiedene Epitope besitzen. Ein Antikörper bindet nur mit einem Epitop. Jedes einzelne Epitop vermag eine Antikäörperbindung auszulösen.
Immunogänität
Die Immunogenität ist die Eigenschaft eines Stoffes, die eine Immunantwort des Immunsystems auszulösen. Das heisst, wie wahrscheinlich (%) ist es, Antikörper gegen ein Antigen zu bilden.
Blutgruppensysteme
Es setzt sich aus einem oder mehreren Antigenen zusammen. Diese Antigen werden von einem Gen oder von mehreren eng verbundenen ähnlichen Genen kodiert.
Aktuell ind 43 Blutgruppensysteme bekannt. Mit bis zu 46 Antigenen pro System.
Genlocus
Die Stelle auf einem Chromosomen, die für die bestimmten Eigenschaften z.B. für ein Antigen, codiert.
Beispiel: Auf Chromosom 9 codiert Locus 9q34 die AB0-Blutgruppe.
Allele
Allele sind bestimmte Gene, welche zwischen Individuen einer Spezies variieren können.
Grundsätzlich besitzen wir immer jeweils ein Allel der Mutter un eines des Vaters.
Genotyp
Es ist das genetische Erbbild. Die vererbten Eigenschaften können nur mittels molekulargenetischen Methoden nachgewiesen werden. Je nach Vererbung werden Antigene exprimiert (gebildet) oder nicht.
Phänotyp
Es ist das Erscheinungsbild. Also die Antigen welche tatsächlich exprimiert (gebildet) werden und serologisch Nachweisbar sind.
Möglicher Genotyp des Phänotypen der blutgruppe A ist: AA oder A0
Homozygot und Heterozygot
Da wir jeweils ein Chromosomensatz der Mutter als auch des Vaters erben, erhalten wir für jedes Antigen mind. 2 Allele.
Wenn beide Allele eines Individuums für ein bestommtes Merkmal gleich sind, ist das Erbgut, bezogen auf dieses Merkmal, homozygot.
Liegen dagegen zwei verschiedene Allele vor, wird dies als heterozygot bezeichnet.
Dominant
Ist eine genetische Eigenschaft dominant, drückt sich diese immer im Phänotyp aus, auch wenn sie heterozygot vererbt wurde. -> Antigen A und B sind dominant über 0
Codominant
Ist eine genetische Eigenschaft, kommen beide vererbten Eigenschaften phänotypisch vor.
Antigen A und B sind codominant = Blutgruppe AB
Rezessiv
Ist eine genetische Eigenschaft, wird sie phänotypisch nur sichtbar, wenn sie homozygot vererbt wurde.
Antigen 0 ist rezessiv zu A und B.
Antikörper
Sind Proteine, sie werden Immunoglobine bezeichnet und sind im Serum/Plasma nachweisbar.
Sie werden nur gebildetet wenn der antikörperbildenden Organismus das entsprechende Antigen nicht besitzt. In der Immunhämatologie spricht man häufig von irregulären Antikörpern. Das heisst, es muss eine Alloimmunisierung stattgefunden haben.
Antikörper reagieren spezifisch, dass heisst sie binden nur an diejenige Antigenstruktur (EPitop), welche die Bildung des Antikörpers hervorgerufen hat. Sie Spezifität eines Antikörpers ist also die Eigenschaft nur mit einem ganz bestimmten Antigen eine Verbindung einzugehen. Man soricht vom korrespondierenden Antigen bzw. korrespondierenden Antikörper.
In der Immunhämatologie wird hauptsächlich mit IgG und IgM Antikörper gearbeitet bzw. diese indentifiziert.
IgG
Die meisten irregulären Ak sind IgG.
Ihr Reaktionsoptimum (um eine Bindung einzugehen) ist bei 37°C, das heisst sie sind Wärmeaktiv.
IgG sind inkomplette Antikörper. Das heisst, sie gehen eine Bindung mit dem korrespondierenden Antigen ein, vermögen es aber nicht mit einem benachbarten Erythrozyt direkt zu agglutinieren. Um eine IgG vermittelte Bindung sichtbar zu machen, benötigt es in der Immunhämatologie Hilfsmittel.
IgG Antikörper sind plazentagägig. Das heisst sie können bei einer
Schwangeren über die Nabelschnur zum Fötus gelangen
IgM
Die meisten natürlich vorkommenden Antikörper sind IgM.
Ihr Reaktionsoptimum (um eine Bindung einzugehen) ist bei 4°C, das heisst IgM Antikörper sind kälteaktiv.
IgM sind komplett reagierende Antikörper. Das heisst, sie vermögen zwei oder mehr benachbarte Erythrozyten direkt und ohne Hilfsmittel zu agglutinieren.
IgM sind nicht plazentagängig.
Komplette Antikörper
Komplette Antikörper sind typischerweise IgM Antikörper. Sie sind gross genug um den Abstand und die Ladung zwischen zwei oder mehreren Erythrozyten zu überwinden und diese zu einer sichtbaren
Agglutination zu führen.
Inkomplette Antikörper
nkomplette Antikörper sind typischerweise IgG Antikörper. IgG Antikörper sind nicht gross genug um zwei Erythrozyten ohne Hilfsmittel zu binden und zu einer sichtbaren Agglutination zu führen.
Deshalb wird im immunhämatologischen Labor mit verschiedenen Hilfsmitteln, wie Rinderalbumin, Dextrane, PEG, Polybrene, proteolytische Enzyme oder einen weiteren Antikörper als
Bindeglied gearbeitet.
Polyklonale Antikörper
Jede Plasmazelle kann nur einen Antikörper gegen ein Epitop synthetisieren. Kommt ein Individuum in kontakt mit einem Fremdantigen (Erythrozyt, Bakterium ect.) werden viele verschiedene Antikörper gegen verschiedene Epitope des Antigens gebildet. Die Gesamtheit dieser verschiedenen Antikörper gegen ein Antigen nennt man polyklonale Antikörper.
Monoklonale Antikörper
Bei der kommerziellen Antikörperherstellung werden monokolnale Antikörper durch Hybridomzellen hergestellt. Dabei werden Tiere (meist Mäuse, Ratten oder Hasen) mit einem Antigen immunisiert. Bei genügender Immunantwort, werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellinien fusioniert, welche in der Lage sind sich zu Teilen und nun einen Typ Antikörper zu synthetisieren, also monoklonale Antikörper.
Die chemische Natur der AB0-Antigene
- AB0-Antigen bestehen aus Zucker - durch das sequenzielle Zusammenwirken unterschiedlicher Glycosyltransferasen entstehen die A- und B-Antigene
- Ausgangspunkt der Antigene ist die Vorläufersubstanz oder auch Grundsubstanz genannt
- durch anfügen einer Fructose wird die HSubstanz (H-Antigen) gebildet = Blutgruppe 0
- Durch anfügen einer Galaktose (= Blutgruppe B) oder Acetylgalaktosamin (= Blugruppe A)
wird die Blutgruppe A, B oder AB gebildet
Isoagglutinine
Das AB0-System ist bisher das einzige Blutgruppensystem, welches obligat natürliche Antikörper gegen das nicht vorhandene Antigen besitzt. Diese Antikörper werden Isoagglutinine genannt und sind lebenslang vorhanden. Es sind kälteaktive, komplette Antikörper der Klasse IgM und somit fähig ohne Hilfsmittel zu Agglutination und mehr oder weniger starken Komplement Aktivierung zu führen. Isoagglutinine sind nicht von Geburt an vorhanden, sondern bilden sich erst nach einigen Lebensmonaten (ab 6. Lebensmonat).
Da die Oligosaccharide der AB0-Blutgruppe in der Natur weit verbreitet sind (insbesondere beim Bakterium E. coli) bildet der menschliche Organismus nach Kontakt, Antikörper entsprechend der nicht vorhandenen Antigene.
A Untergruppen
Bei der Blutgruppe A können verschiedene Untergruppen Nachgewiesen werden (A1, A2, A3, Ax, Am ect.)
80% aller Personen mit Blutgruppe A sind A1 resp. A1B und 20% sind A2 resp. A2B.
Weitere A-Untergruppen kommen selten vor.
Die A-Untergruppen unterscheiden sich im Aufbau der Antigene und deren Antigenstärke.
Ob jemand Blutgruppe A1 oder A2 hat ist nicht transfusionsrelevant.
Die Unterscheidung der A Untergruppen erfolgt einerseits über die H-Substanz und andererseits über die Bestimmung der A1 Antigene mittels Anti-A1-Lectin.
Anti-A1-Lectin sind Antikörper welche nur gegen A1 Antigen gerichtet sind und diese binden.
Anti-H Antikörper binden nur gegen H-Substanz.
Da Blutgruppe A1 und A1B zu wenig H-Substanz besitzt, werden die Reaktionen bei A1 und A1B mit Anti-H negativ. Folglich ergibt sich dieses Reaktionsmuster:
Blutgruppe Bombay
Die H-Substanz bildet somit die Grundlage der Blutgruppen A und B. Bei einem extrem seltenen NullPhänotyp wird das Antigen H (die H-Substanz) nicht gebildet. Folglich kann auch keine A oder B Blutgruppe gebildet werden. Diese Blutgruppe nennt sich Bombay.
Diese Blutgruppe bildet neben sehr starken A und B Isoagglutininen auch obligat ein Anti-H (Anti-0) Isoagglutinin.
Folgend darf eine Person mit der Blutgruppe Bombay auch nur Blut des Typs Bombay
transfundiert werden.
Transfusionsschema
Entsprechend der vorhandenen Antigene bzw. der Isoagglutinine ergibt sich folgendes
Transfusionsschema.
Das Rhesussystem
Das Rhesussystem ist nach dem AB0 System das zweit relevanteste System für die praktische Immunhämatologie.
Im Gegensatz zum AB0 System besteht das Rhesussystem aus Proteinen und hat mehr Antigene zur Unterscheidung. Von Bedeutung für die Immunhämatologie sind die Antigene D, C, c, E, e und (Cw). Von diesen ist mit Abstand das Antigen Rhesus D, welches auch als Rhesusfaktor bezeichnet wird, von höchster Bedeutung.
Rhesus D positive Personen nennt man Rhesus positiv, Rhesus D negative Personen Rhesus negativ.
Rhesus D hat eine sehr hohe Immunogenität. Nach einmaliger Transfusion eines Rhesus D positiven Präparates wurde bei D negativen Probanden eine Immunisierung (Antikörperbildung) von bis zu 80% beobachtet.
Die Antigene des Rhesussystems werden von zwei benachbarten Genen codiert. Das Antigen D wird vom Rh-D-Gen codiert. Bei D-negativen fehlt das Gen fast immer vollständig.
Die Antigene C, c, E und e werden vom Rh-CE-Gen codiert.
– Das Rhesus Protein durchquert 12 mal die Erythrozytenmembran
– Das Protein selbst dient als Transportprotein
– Landsteiner und Wiener entdeckten es 1940 und benannten es nach dem Rhesus-Affen mit dem sie die Tests durchgeführt hatten
Die Vererbung des Rhesus D ist gleich wie beim AB0-Stystem Das Rhesus D Antigen ist Dominant. Erhält man ein Allel des Elternteils, dass das Rhesus D codiert (besitzt), spielt es keine Rolle, ob das zweite Allel ebenfalls für das Rhesus D codiert, da man sowieso
Rhesus D positiv ist.
Bei den Antigenen C, c, E und e verhält es sich mit der Vererbung anders. Sie erhalten jeweils von den Eltern ein «Paket» an Rhesus-Genen. Beispielsweise Cde oder cDE. Da sowohl das C als auch c ein Antigen sind, bilden Sie alle Antigene aus, welche Sie erhalten.
Präanalytik
– korrekte Röhrchen (meist EDTA und/oder Serum ohne Trennmittel)
– Blutentnahme Best möglichst von einer frischen Punktion, falls von einem Zugang -> gut Spülen / Blut verwerfen -> Verdünnungsgefahr
– Patientenidentifikation und Beschriftung der Blutentnahme mind. Vor-, Nach- Name und Geburtsdatum
– korrekt Verordnung und Entnahmezeit ersichtlich (Auftragsformular / LIS)
– Falls die Blutgruppe noch nie bestimmt wurde, soll, um allfällige Verwechslungen aufzudecken, je eine vollständige Blutgruppenbestimmung an zwei unabhängig voneinander entnommenen Blutproben mit jeweils unabhängiger Patientenidentifikation durchgeführt werden.
– Probenröhrchen werden vor der Analyse zentrifugiert.
– Die Proben müssen mindestens 7 Tage nach der Entnahme im Labor aufbewahrt werden
CAVE: Mit nicht angeschriebenen oder nicht zuzuordnenden Blutproben dürfen keine
prätransfusionellen Untersuchungen durchgeführt werden.
Ausgangslage
Das Prinzip der Röhrchentechnik
In der Röhrchentechnik, wird in der flüssigen Phase gearbeitet. Dem Röhrchen werden Antiserum und Erythrozytensuspension zugegeben und gemischt.
Bei komplett reagierenden Antikörpern (Isoagglutinine) agglutinieren die Erythrozyten (sofern das korrespondierende Antigen vorhanden ist) direkt. Nach einer Zentrifugation kann die Reaktion durch
sorgfältiges Schwenken abgelesen werden.
Reaktionsstärke in der Röhrchenmethode
Das Prinzip der Gelzentrifugation
Die Karten bestehen aus Kunststoff und 6 Mikrotitersäulen.
Die Kammern sind in der Regel leer.
Im Gel befinden sich Plastikkugeln und je nach Test auch Antikörper.
Das ID-System besteht aus einer speziell entwickelten Mikroküvette, welche in eine Reaktionskammer und ein Gel unterteilt ist. In die Reaktionskammer wird entweder ein Reaktionsgemisch (EC und AK) oder eine Erythrozytensuspension pipettiert. Das Gel besteht aus Sephadexkugeln und hat die Funktion eines Filters. Dem Gel sind entsprechende Antikörper oder Reagenzien beigefügt. Nach Zugabe einer Probe und anschliessender Zentrifugation werden die agglutinierten Erythrozyten von nicht agglutinierten Erythrozyten deutlich getrennt.
Wichtig: die Karten sollten nicht hingelegt oder auf den Kopf gestellt werden, da sonst das Gel in die
Kammern läuft.
Reaktionsstärken in der Gelmethode
Die Reaktionen werden in der Immunhämatologie mit + (kreuz) angegeben.
4+ = sehr stark positive Reaktion
3+ = starke positive Reaktion
2+ = positive Reaktion
1+ = schwache positive Reaktion
0 = negative Reaktion
Gel- Methode
Vor- und Nachteile
Vorteile Gel-Methode
– Standardisierung und Automatisation
– Reagenzien bereits im Gel = Zeitersparnis
– grundsätzlich keine Wachvorgänge nötig
– eindeutigere Ergebnisse
– Reaktionen sind «haltbar»
– hohe Sensitivität
Nachteile Gel-Methode
– Nicht für Kälteantikörper-Abklärung geeignet
– Zeitaufwand für BG-Bestimmung höher
Röhrchen-Methode
Vor- und Nachteile
Vorteile Röhrchen-Methode
– Flexibilität
– geeigneter zum Nachweis von Kälteantikörper
– BG-Bestimmung zeitlich schneller
Nachteile Röhrchen-Methode
- Keine Automatisation möglich
- Mehr Arbeitsschritte
- Waschvörgange notwendig
- Interpretation personabhängig und bedarf einer Routineerfahrung
- Reaktionen nicht "haltbar"
Antihumanglobulin
Komplett reagierende IgM Antikörper können ohne Hilfsmittel sichtbare Agglutinationen hervorrufen. Was machen wir nun mit inkompletten IgG Antikörper?
Es benötigt einen weiteren Antikörper zur Überbrückung der Distanz zwischen den Erythrozyten.
Das sogenannte Antihumanglobulin (AHG)
– Antihumanglobulin sind IgG Antikörper die gegen den FC-Teil von humanen IgG Antikörpern gerichtet sind
– Zur Herstellung wurden Kaninchen gegen menschliche IgG Antikörper immunisiert
– Daraus entstanden Antikörper gegen menschliche Antikörper
– Trifft nun ein AHG-Antikörper auf einen menschlichen IgG Antikörper entsteht eine Bindung
– Somit lassen sich gebundene inkomplette IgG Antikörper zu einer sichtbaren
Agglutination bringen
Indirekter Antihumanglobulintest
Indirekt = Nachweis von frei «schwimmende» Antikörper im Serum oder Plasma der Patient*innen
Die Methode des IAT ermöglicht es inkomplette Antikörper mit Testerythrozyten agglutinieren zu lassen.
Der IAT ist die wichtigste Untersuchungsmethode zum Nachweis und zur Spezifizierung von freien, irregulären, wärmeaktiven, antierythrozythären Antikörpern der IgG-Klasse
1. Stufe: Das Patientenserum wird zusammen mit Testerythrozyten bei 37°C inkubiert. Ein allfälliger Antikörper kann sich mit dem korrespondierenden Antigen verbinden. Diese Reaktion ist nicht sichtbar.
2. Stufe: Um die Reaktion sichtbar zu machen, wird im IAT ein zweiter Antikörper eingesetzt. Das Antihumanglobulin (AHG) ist spezifisch für den Fc-Teil des IgG-Moleküls.
Die Funktion des AHG ist das «Brückenschlagen» zwischen zwei IgG beladenen Erythrozyten um so den Antikörper-Antigen-Komplex zu einer
sichtbaren Agglutination zu führen.
Direkter Antihumanglobulintest
Direkt = Nachweis von bereits in vivo (im Lebenden) gebundene Antikörper an den Erythrozyten der
Patient*innen
LISS
Erythrozyten sind von einer festen positiv- und negativ-geladenen Elektronenwolke umgeben (elektrostatische Barriere). Die Summe der Ladungen wird auch als Zeta-Potential bezeichnet. IgG Antikörper prallen im ersten Moment an dieser ab. Trotzdem gelingt es den Antikörpern nach einer gewissen Zeit (30-60min) an das korrespondierende Antigen zu binden.
Um die Bindung der Antikörper im Labor zu beschleunigen wurde die LISS Lösung eingeführt. LISS bedeutet low ionic strength solution zu deutsch niedrig geladene Stärkelösung. Die LISS Lösung führt zu einem Aufquellen der Erythrozyten, dadurch werden die Antigene besser präsentiert und ein herabsetzen des Zeta-Potentials.
Durch die Verwendung der LISS Lösung kann die Bindung von inkompletten IgG Antikörpern innerhalb
von 15 Minuten statt finden (anstelle von 30-60 Minuten).
Das Type and Screen
Ist zur Vermeidung von Probenverwechslungen und hämolytischen Transfusionsreaktion durchgeführt = Patientensicherheit.
Type: AB0/D Blutgruppen-Bestimmung resp. AB/D-Kontrolle der Patientenerythrozyten.
AB/D-Kontrolle der Spendererythrozyten (des Erythrozytenkonzentrats)
Screen: Antikörpersuchtest zum Nachweis von möglichen irregulären antierythrozytären Antikörpern im Serum/Plasma des Patienten.
CAVE: eventuell muss zusätzlich ein Rhesus-/K-Phänotyp und oder direkter Antihumanglobulintest bestimmt werden.
