Tiergenetik

1. Translationsstimulation durch Stabilisierung von PABP (Poly-A Binding Protein)

2. Translationsinhibition durch Ribosom Assemblierung Inhibition

3. Verfrühte Translations Termination über Bindung ans 3‘ Ende

4. Abbau Poly-A (Bindung an 3‘ UTR)

5. AGO 2 Splicing der miRNA

Extrazelluläre Vesikel (EV) sind durch Lipiddoppelmembranen abgegrenzte, nicht selbst- replizierbare Partikel. Es gibt Microvesikel, Apoptotic Bodies und Exosomen. Alle Typen sind von einer Lipid Doppelmembran umgeben und enthalten ein spezifisches Cargo.

EVs werden, als Drug Delivery Systems (DDS) genutzt, um Bioverfügbarkeit zu erhöhen und über eine organotrope Wirkungsweise Nebenwirkungen zu reduzieren.

1. Translokasen ändern Membranbeschaffenheit (vgl. Phosphatidylserin)

2. Actomyosin kontrahiert und begünstigt Budding => Vesikel-Bildung & Ablösung

3. ESCRT abhängiger Pfad => ESCRT-III sorgt für Vesikelabschnürrung

Exosomen bilden sich durch Bildung von Multivesicular Bodies, die mit der Plasmamembran fusionieren und dadurch die inneren Vesikel in den Extrazellularraum freisetzen. Der besondere Schritt ist, dass in das Early Endosome, Vesikel hineinknospen. Dies bezeichnet man auch als inward budding.

Tetraspanin-Mikrodomänen an der Membranaußenseite des Endosoms begünstigen inward-budding und cargo clustering im Multivesicular body. 

Es gibt viele funktionale wichtige Moleküle. Als Beispiel Anheftungsfaktoren zu nennen, wie Transmembranproteine (z.B Integrin) oder Rezeptoren, die bei dem Andocken der Exosomen an der Plasmamembran helfen. Exosomen enthalten darüber hinaus Hilfsmoleküle für intracellular trafficking (RAB-GTPasen, Annexin).

• miRNA
• mRNA
• Proteine

Exosomen besitzen spezifische Liganden auf der Membran, die an Rezeptoren der Zielzelle binden.

Exosomen werden als Drug Delivery Systems benutzt, um Bioverfügbarkeit zu erhöhen und Nebenwirkungen zu verringern.

EVs werden als objektive, schnelle, präzise und objektiv messbare Biomarker genutzt, weil Sie unteranderem miRNA enthalten, die krankheitsspezifisch in EVs zu finden sind.

Pathologisch: Induktion von Angiogenese bei Oncosomen

Biologisch: Interzelluläre Kommunikation

• Exosomen über Flüssigkeitsbiopsie isolierbar.
• Schützen miRNA vor Abbau und verbesserte Stabilität => dadurch bessere Sensitivität und Spezifität bei miRNA Biomarker Analyse

EV als Molekulare Biomarker für miRNA

• Definiertes molekulares Merkmal, das als Indikator gemessen wird, z. B. für eine Krankheit

• Steht in direktem Zusammenhang mit einer bestimmten Krankheit

• Präzise, reproduzierbare und schnelle Auswertung auf objektive Art und Weise

Vorteil von EV miRNAs

• Nicht-invasive Flüssigbiopsie

• Kurz = stabil

• Spezifische Information

• Frühe Bewertung zellulärer physiologischer Veränderungen

• Leicht zu quantifizieren bei sehr geringer zellulärer Abundanz

=> untersuchen mit NGS Illumina etc. (siehe andere VL), Quantifizierung, Aufreinigung (Purification), Größenauswahl, Qualitätskontrolle

Stimulus: intrinsic pathway intrazellulärer Stress, extrinsic pathways über death receptors

Ablauf (Entstehung auf Grafik):

1. Durch Anstieg des hydrostatischen Drucks werden die Bestandteile der Zellflüssigkeit zur Plasmamembran gedrängt => Blebbing

2. Kaspase 3 induzierte Proteinkinasenaktivierung bewirkt Actomyosinkontraktion => Blebbing

3. Mikrotubuli Assembly zu Spikes u. Apoptopodia Bildung führt zu Blebbing

Die entstehenden Apoptic Bodies werden über Phagozytose kontrolliert verdaut (efferocytosis).

Antigen = Moleküle die vom Immunsystem erkannt werden und eine Immunantwort auslösen z.B Glykoproteine, Polysaccharide, Proteine

Epitop = Bindestelle von Antigen, an den ein Antikörper bindet

=> Unterscheidung so wichtig, weil im MHC Komplex, nur dieses Peptidfragment des Antigenproteins vom T-Zellrezeptor gebunden wird

Paratop = Antikörper Bindestelle, die das Antigen (Epitop) bindet

(1) Körper erzeugt viele verschiedene T-Zellen mit unterschiedlichen Spezifitäten

(2) Klonale Deletion: Von diesen Vorläuferzellen werden, diejenigen aussortiert, die körpereigene Antigene (Epitope) binden => Verhinderung der Autoimmunreaktion 

(3) „Pool“ verschiedene T-Zellen zirkuliert im Körper

(4) Bei Erkennung eines fremden Antigens durch T-Zelle: klonale Expansion und Differenzierung

4 Basis Prinzipien der Theorie:

1. Jede Lympozyte hat ein Rezeptor mit einzigartiger Spezifität gegen ein Antigen

2. Durch Bindung des Lymphozytrezeptors an das Antigen, wird die Lymphozyten Zelle

   aktiviert => Vermehrung + Differenzierung

3. Jede differenzierte Zelle hat einen identischen Rezeptor wie die Ursprungszelle

4. Naive Lymphozten die reaktiv gegen eigene Körperzellen sind, werden aussortiert

Effektor-Gedächtniszellen (Tem), zentrale Gedächtniszellen (Tcm)

Somatische Rekombination (VDJ Recombination) von V (Variable) D (Diverse) J (Joining) C (Constant) Regionen

α-Kette = V, J, C Elemente Recombination & Splicing und Translation 

ß-Kette = V, J, D, C Elemente Recombination & Splicing und Translation 

Dadurch ergeben sich vielfältige Kombinationen, an möglichen variablen Regionen. 

The enzymes RAG-1 and RAG-2 are essential for V(D)J recombination.

Additional receptor variation is created by non-homologous end joining (NHEJ).

• The epitopes recognized by TCR are often buried. The antigen must first be broken down into peptide fragments. Epitope peptide binds to an MHC molecule. The TCR binds to a complex of MHC and epitope peptide. 
• MHC exists in 2 forms and presents antigen to T-cells that express different coreceptors (CD4 & CD8)
• CD8 T cells recognize peptides that are bound to MHC I and CD4 T cells recognize peptides presented by MHC II 

CD4+ T Helfer-Zellen: sezernieren unterschiedliche Zytokine.

CD8+ cytotoxische T-Zellen (Killerzellen): Sie besitzen CD8+-Heterodimere an der Oberfläche und erkennen auf MHC-I-Molekülen präsentierte Antigene und lösen in den defekten Zellen über Signalwege den programmierten Zelltod aus. 

T-Gedächtniszellen: bilden eine Art „immunologisches Gedächtnis“, indem sie nach ihrer Aktivierung im Blut verbleiben. Bei einer erneuten Infektion desselben Erregers wird die ursprüngliche Aktivierung wiederhergestellt. Die Gedächtnisrolle kann sowohl durch CD4⁺ als auch durch CD8⁺-T-Gedächtniszellen ausgeübt werden. 

• Effektor-Gedächtnis-T-Zellen: können besonders schnell durch ihr Antigen aktiviert werden und sezernieren dann innerhalb weniger Stunden Interleukine. 
• Zentrale Gedächtnis-T-Zellen: Sie sind leichter aktivierbar als naive T-Zellen und benötigen weniger Kostimulation, um aktiviert zu werden. Sie produzieren Interleukine. Nach ersten Vermehrungsphase differenzieren sie in Effektorzellen. 

Natürliche Killerzellen (NK-T-Zellen): Besitzren keine antigenspezifischen Rezeptoren, aber können dennoch die Präsentation von MHC-I-Antigenkomplexen erkennen.

=> drei Hauptwege zur Eliminierung infizierter/Krebszellen

1) Sekretion von Zytokinen (TNFα und IFNγ)

2) Freisetzung zytotoxischer Granula (Perforin und Granzyme)

3) FasL-Fas-Signalisierung (apoptotische Caspase-Kaskade)

Humorale Immunantwort: wird durch Antikörper verursacht, welche in Körperflüssigkeiten zu finden sind (Blut, Gewebeflüssigkeit, Sekretionen). Antikörper können bakterielle Toxine neutralisieren, Bakterien in extrazellulären Raum mittels Opsonization markieren, welche dann mittels Makrophagen zerstört werden. Sie können auch das Komplementsystem aktivieren, in dem die Lyse der Zelle stattfindet.

Zelluläre Immunantwort: Dabei verursachen die T-Zellen die Immunantwort (CD8 T Zellen -cytotoxische Killerzellen- und CD4 T Zellen - Helferzellen-)

Der Hauptunterschied besteht in den Elementen, welche in den Prozess der Immunreaktion involviert sind. Die zelluläre Abwehr erfolgt durch Zellen (vor allem T-Lymphozyten), wobei bei der humoralen Immunabwehr Antikörper beteiligt sind.

Nachteil:

• Antikörper: Ändern sich schnell 

Vorteil:

• Gedächtnis-T-Zellen (Tem & Tcm) bieten lang anhaltende Immunüberwachung. Selbst nachdem die Infektion abgeklungen ist, patrouillieren noch Gedächtniszellen, um zu sehen, ob es eine erneute Infektion gibt.

• Representieren von Antigene ohne dabei das eigentliche Pathogen einzureichen, somit ein Immunantwort gegen diesen spezifischen Antigen gebildet werden kann, aber das Organismus nicht in Risiko geraten wird. 

Akute Infektion:

= Infektion die wieder abklingt

1. Expansionsphase: starke Expansion d. T-Zellen (bis ca. Tag 8)

2. Kontraktionsphase: Absterben der virusspezifischen T-Zellen (bis ca. Tag 21)

3. Memory-Phase: 10% d. Zellen bleiben stabil als Gedächtniszellen erhalten

Chronische Infektion:

T-Zellen interagieren dauerhaft mit viralem Antigen, es tritt keine Kontraktionsphase ein, (High virus titers and fast replicating virus induce dysfuntional T cells) die T-Zell werden dysfunktional mit verringerter Effektoraktivität (T-cell exhaustion); Reguliert über Transkriptionsfaktor TOX

z.B CD8+-T Killer Cells produzieren weniger Cytokine und exprimieren inhibitorische Rezeptoren (PD-L1)

Schließlich tritt sogar eine Deletion spezifscher T-Zellen ein und weil die Kontraktionsphase nicht endet, werden keine Gedächtniszellen gebildet.

z.B HIV, Tumore (Krebs)

1. Zellgröße & Granularität

- Foward Scatttering: Beugung im flachen Winkel = Größe der Zellen

- Side Scattering: Beugung im rechten Winkel = Granularität

=> Auftragung im Foward Scatter – Side Scatter Plot => Bestimmung d. Zelltyp

2. Phänotyp & Zellzahl: Makierung spezifischer Rezeptoren

Abtrennung der Population durch mehrfach Fluoreszenzmessung

Über Eichpartikel kann die relative Zellzahl bestimmt werden (Eichpartikel benötigt für Absolutzellzahl)

3. Viabilität:

Nutzung d. Zellmembran-undurchlässiger, aminreaktiver Farbstoffe (z.B Zombie Dyes)

Lebende Zellen: Weniger Fluoreszenz, da nur Oberflächenproteine markiert werden

Tote Zellen: Viel Fluoreszenz, da Membranintegrität beeinträchtigt und auch cytoplasmatische Proteine markiert werden

4. Proliferation:

-  Carboxy-Fluorescin-N-succinimidylester (CFSE)

-  Nicht fluoreszierender Farbstoff diffundiert passiv durch Zellmembran und wird von intrazellulären Esterasen gespalten

- Spaltungsprodukt fluoresziert und lagert sich an Proteine an

Prinzip: Bei Teilung wird der Fluoreszenzfarbstoff, gleichmäßig auf beide Tochterzellen aufgetrennt. Durch die progressive Aufteilung der Fluoreszenzintensität der Zellen, kann abgeschätzt werden, wie stark die Zellen proliferiert sind ( 1te Generation: 100% Fluoreszenz 2te Generation 50% Fluoreszenz => 25 % Fluoreszenz bei einer Zelle detektiert, muss damit zur 3ten Generation gehören)

adaptives Immunsystem:

• Mutantenspezifische oder Stammspezifische Antigene
• Erkennung von Antigenen
• muss zuerst durch klonale Expansion und Differenzierung in der Expansionsphase hochgefahren werden (verzögerte Abwehr - slow response)
• entwickelt sich erst im Laufe des Lebens (immunologisches Gedächtnis)
• somatic recombination => variability in antibodies => highly specific TCRs and BCRS => clonal response

angeborenes Immunsystem:

• nicht-spezifisch, breitspezifisch (broadly expressed, highly conserved => PAMP)
• Erkennung von PAMP (Pathogen associated molecular patterns)
• bereits seit Geburt vorhanden, preexisting effector cells and molecules
• nach ca. 4h des Übertreten anatomischer Barrieren (rapid response)

Angeboren: Granulozyten, Makrophagen

Adaptiv: B-Lymphozyten, T-Lympohzyten

Definition: Endonukleasen, die DNA an bestimmten (palindromischen) Erkennungssequenzen schneiden

Arten: 

• RE, die blunt ends (SmaI) erzeugen
• RE, die sticky ends (EcoRI) erzeugen

weiterhin Unterscheidung in Klassen:

Typ I = zufällige Schnittstelle, ATP, S-Adenosyl-Methionen (Methyltransferdonor) benötigt für Methyltransferase Aktivität

Typ II = schneidet innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz; kein ATP benötigt und keine Methyltransferase-Aktivität

Typ III = schneidet DNA etwa 20-25bp von der Erkennungssequenz entfernt; ATP und SAM benötigt

Typ IV = schneidet nur methylierte/hydroxymethylierte/glucosyl-hydroxymethylierte DNA; Inhibierung nur über spezifische Methylierungsmuster

Inhibierung: Methyltransferasen methylieren Erkennungssequenzen (Restriktions- Modifikationssystem schützt Wirt-DNA), z.B. CpG, Dcm oder Dam

Anwendung: Schneiden von Plasmiden (Vektoren)/Gene of Interest zur Gen-Insertion (Klonierung)