MiBi 2

v.a. (Ribosomale) Proteine (Proteinfingerabdruck).

• Richtwerte: (KBE Anzahl darf das Produkt haben)
• Orientierung, welche produktspezifischen MO zu erwarten sind
• welcher MO-Gehalt bei Einhaltung guter Rohstoffqualität und Hygienepraxis akzeptabel ist
• Warnwerte: (KBE Anzahl die Maßnahmen erfordert)
• Angabe des MO-Gehalts bei deren Überschreitung ein Hinweis vorliegt, dass gute Herstellungs- und Hygienepraxis verletzt wurde
• Für Verderbs-Organismen à kein Warnwert
• Warnwertüberschreitung: Gesundheitsgefärdung des Verbrauchers möglich

• Rechtlich nicht bindend
• Geben Wirtschaft und Behörden Grundlage zur Beurteilung des mikrobiologischen –hygienischen Status eines LM
• Gelten für in Verkehr befindliche LM, während der Haltbarkeitsdauer
• Berücksichtigt MO, die für gesundheitlichen Verbraucherschutz und für spezifische Beschaffenheit eines Produkts relevant ist
• DGHM-Werte gelten auf allen Stufen der Verarbeitung, des Vertriebs und des Verkaufs

• Eukaryotisch:             S. cerevisiae
                                       à Hefen, diese befinden sich im Boden, auf den Blättern & Trauben
                                       à vergären den Fruchtzucker der Trauben zu Alkohol + CO_c
                                                                    (Spontangärung oder Reinzuchthefen-Zugabe)

• Prokaryotisch:            Milchsäurebakterien (Oenococcus oeni)
                                      à für biologischen Säureabbau (malolaktische Fermentation
                                           während der Nachgärung
                                      à Apfelsäure à Milchsäure + CO₂

Typisierung von pathogenen MO, welche aus ähnlichen Fällen während eines Ausbruchs isoliert wurden, liefert wichtige Information zur Herkunft und Verbreitung der jeweiligen Keime

Microbial Source Tracking (MST) beschreibt eine Untersuchungsstrategie zur Bestimmung von fäkalen Verschmutzungsquellen in Umweltgewässern, die auf der Assoziation bestimmter fäkaler Mikroorganismen mit einem bestimmten Wirt beruhen.

a) Infektionserreger: Vermehrung im Körper -> Darm (manche auch schon im LM)

b) Intoxikationserreger: ausschließliche Vermehrung im LM  (Toxinbildung bei großer Erregerkonzentration im LM)

Anmerkung: Unterschied Infektion und Intoxikation

- Infektion: längere Latenzzeit 1-3 Tage -> Erreger rufen Entzündungen hervor
- Intoxikation: kürzere Latenzzeit 2-6h -> Kontamination mit bakteriellen Giften (Toxinen)

Natürliche Resistenz • 1) fehlender Angriffspunkt, z.B. Mykoplasmen (keine Zellwand, resistent gegen ß-Lactam AB) • 2) Barriere gegen das Eindringen von AB, z.B. äußere Zellmembran bei Gram-negativen Bakterien • 3) Efflux-Pumpen transportieren AB aus der Zelle, z.B. bei Pseudomonas aeruginosa

• Natürliche Mutation (Veränderung Wirkort, Verhinderung Zugang zum Wirkort)

• Übertragung von Resistenzgenen durch horizontalen Gentransfer (Inaktivierung oder Efflux)

ESBL-bildende Bakterien • produzieren Betalaktamasen mit erweitertem Wirkungsspektrum: inaktivieren Penicilline und Cephalosporine • codierende Gene der Betalaktamasen sind oft auf Plasmiden lokalisiert 

MRSA (Methicillin-resistente Staphylococcus aureus)

• Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme und weitere Antibiotikaklassen sind unwirksam

• 3 Gruppen von MRSA:

1) Stämme, die in der Klinik übertragen werden (hospital acquired MRSA)

2) Stämme, die außerhalb der Klinik von Mensch zu Mensch übertragen werden (community acquired MRSA)

3) Stämme, die bei Nutztieren verbreitet sind und bei Menschen gefunden werden, die mit Nutztieren Kontakt haben (livestock associated MRSA)

 Bouillonverdünnungstest: • Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK; minimum inhibitory concentration, MIC), auch Mikrodilutionstest (Mikrotiterplatten, plate reader) • Automatisierte Systeme z.B. VITEK von bioMérieux, Phoenix von Becton Dickinson

2) Agardiffusionstests - Plättchentests

Sensibel: MHK ≤ Grenzkonzentration („unterer breakpoint“). MHK ist so gering, dass bei Therapie mit der üblichen Dosierung i. A. ein Therapieerfolg zu erwarten ist.

• Resistent: MHK ≥ Grenzkonzentration („oberer breakpoint“). MHK ist so hoch, dass kein Therapieerfolg zu erwarten ist.

• Intermediär: MHK in einem Bereich (zwischen zwei Grenzkonzentrationen) für den keine Beurteilung hinsichtlich des zu erwartenden Therapieerfolges möglich ist

Die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass Microbial Source Tracking mit wirtsspezifischen DNA-Markern für den Einsatz in der Praxis geeignet ist. Zusammen mit der Betrachtung der örtlichen Gegebenheiten ist Microbial Source Tracking ein hilfreiches Werkzeug bei der Ursachenforschung und der Ermittlung der Herkunft fäkaler Gewässerbelastungen. Damit trägt es wesentlich zu einer zielorientierten Bewirtschaftung des Gewässers bei (Herkunft von beispielsweise E.coli durch Überprüfungen unterschiedlicher Spots und entsprechender Rückverfolgung der Herkunft

Direkte Nachweismethoden • Oberflächenausstrich/Ausplattieren auf festem Medium (Petrischale) • Gussplattenverfahren • Tupferabstrich, evtl. Resuspendierung und Ausstrich • Abklatschverfahren (Platten, „Agar-Film“, etc...) • Anreicherungskultur (Flüssigmedium), selektiv oder nicht-selektiv

Indirekte Nachweismethoden • Immunologische/genetische Verfahren • Nachweis von Metaboliten (ATP, etc...)

• Zellmorphologie: Stäbchen, Kokken, Kommaförmig, Spirillen, filamentös,...

• Färbungen: Gram-Färbung, Geißelfärbung, Kapselfärbung,...

• Fluoreszenzmarkierungen: - Nukleinsäuren (DAPI, Propidiumiodid, Acridin-Orange...) usw

Live/Dead Farbstoffe können lebende und tote Zellen unterscheiden

Latex-Agglutinations-Test • An sehr kleine Latexpartikel gekoppelte AK führen bei Bindung an AG zu einer Quervernetzung und damit zur makroskopisch sichtbaren Verklumpung (Agglutination) positives Resultat

GLISA = Gold-Labeled Immunosorbent Assay für den Nachweis von Mikroorganismen

 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA und „Sandwich-ELISA“)

Antigen wird an eine feste Phase gekoppelt (z.B. Mikrotiterplatte). • Beim Sandwich-ELISA ist der Primärantikörper (Capture) direkt an der festen Phase verankert (häufigste Assay-Form): • Bindung des Antigens (Zielzellen, Proteine, Toxine,...) • Entfernen der ungebundenen Antigene durch Waschschritte • Markieren mit Detection-Antikörper • Waschschritte zur Entfernung ungebundener AK • Nachweis mit Enzym-konjugierten Antikörper: Zugabe von Enzym-Substrat • Messung der Reaktionsprodukte (Farbstoffe, Fluoreszenz)

Gensonden • Gensonden sind kurze Stücke einzelsträngiger DNA (Oligonucleotide, ca. 20-100 Basen) von genau definierter Sequenz, komplementär zur nachzuweisenden Zielsequenz. Nachweis von ribosomaler RNA: • Bestandteil der Ribosomen • drei rRNA-Typen mit unterschiedlicher Größe bei Prokaryoten: 5S, 16S, 23S • hohe evolutionäre Stabilität • typische Struktur

Vorteile der Gensonden-Methoden: • Sehr spezifischer Nachweis mit geeigneten Sonden

Nachteile: • Komplexer Versuchsablauf, geschultes Personal erforderlich • Auch tote Zellen enthalten DNA/RNA mögliche falsch positive Ergebnisse • Kommerziell erhältliche Tests relativ teuer

Microarrays • Microarrays sind miniaturisierte Anordnungen von molekularen Sonden (Nukleinsäuren, Peptide oder Polysaccharide) auf einer ebenen Festkörperoberfläche («chips») • Mit Arrays lassen sich viele Gensequenzen in einem Experiment analysieren Vorteile: • parallele und schnelle Analyse wichtiger diagnostischer Parameter (mRNATranskripte, Proteine,...) • Automatisierung Hürden: • hohe Kosten (Geräte und Reagenzien) • notwendige Standards (für den Interlabor-Vergleich der Daten)

Amplifikation von speziellen Genabschnitten durch spezifische OligonukleotidPrimer mit Hilfe einer DNA-Polymerase und Nachweis des entstehenden Produkts (Gelelektrophorese). • Theoretisch ist der Nachweis eines einzelnen Ziel-DNA Fragmentes möglich, also ein "single-copy" Gen in einer einzelnen Zelle. 

Nachweis möglich mittels Suche nach: Flagelline, Virulezfaktoren, Toxingene etc.

Vorteile • kleinste Mengen von Zielorganismen nachweisbar (auch nicht kultivierbare oder nicht vermehrungsfähige Zellen) • Ergebnis innerhalb von Stunden

Nachteile • Keine Entscheidung ob ein Organismus lebend oder abgetötet ist • PCR-Inhibitoren (z.B. aus Lebensmittelmatrix) falsch negatives Ergebnis • mögliches Kontaminationsrisiko falsch positives Ergebnis

Kriterien für Typisierungs-Methoden

• alle Organismen einer Spezies müssen mit der verwendeten Methode typisierbar sein.

Typisierungsmethoden müssen: - ein hohes Differenzierungs-Potential haben

- sehr reproduzierbar sein 

Vorteil: • Einfache Durchführung, keine Spezialausstattung nötig

Nachteile: • DNA muss frei von Verunreinigungen sein • Differenzierung begrenzt (vor allem kleine Fragmente werden erfasst)

Vorteile: • geeignet für ganze Bakteriengenome • Inter-Labor Vergleichbarkeit der Ergebnisse ("PulseNet", Network for foodborne bacterial disease surveillance, Internationale Standardisierung 

Nachteile: • Aufwändiger als einfache RFLP Methode

5) Phagentypisierung (Phagovarbestimmung, Lysotypie) • Unterscheidung durch unterschiedliche Empfindlichkeit einzelner Stämme einer Spezies gegenüber verschiedenen Bakteriophagen für diese Spezies Muster der Sensitivität Phagovar • 8-10 verschiedene Phagen nötig • sehr feine Differenzierung möglich, oft unterhalb der Serotypebene (Salmonella, Listeria, Staphylococcus,...)

Vorteil: • Einfache und kostengünstige Methode

Nachteil: • Standardisierung der Phagen und Methode schwierig • nicht alle Stämme sind mit Phagen typisierbar

Säuerung der Milch (MSB) Ausfällung des Caseins (Joghurt, Sauermilch) oder Verstärkung der Ausfällung (Käse) und Schutz vor Verderbserreger und Pathogenen

• Lochbildung HÄHÄ durch MSB (heterof.) in Käse (CO2)

• Aromabildung durch MSB (Butter: Diacetyl; Joghurt: Acetaldehyd) sowie durch Schimmelpilze (Roquefort, Camembert-Käse) sowie Rotschmierebakterien (Sauermilchkäse)