Molekularbiologische Techniken

Falsch, die Protease zerstört die Peptidbindungen

0.1-1ul Pipette 1mm tief

1-100ul Pipette 2-3mm tief

100-1'000ul Pipette 2-4mm tief

1'000-10'000ul Pipette 3-6mm tief

1. Kleinstmögliche Pipette
2. Tiefe der Spitze anpassen
3. Pipette senkrecht
4. Prewetting 3x 
5. Flüssigkeit unter 10ul direkt ins Gefäss geben ohne Rand zu berühren, ober 10ul Pipettenspitze am Rand stützen & von dort Flüssigkeit ablassen
6. Langsam und kontinuierliches Arbeitstempo, um präzise und genaue Pipettierergebnisse zu gewährleisten
7. Tubes mit Handschuhen aus Verpackungen nehmen, noch in der Verpackung direkt geschlossen & vor dem pipettieren beschriften
8. Tubes geschlossen halten & nur so kurz wie möglich öffnen
9. Box nur für Entnahme einer Spitze öffnen
10. Spitzen wechseln
11. Spitze kontaminiert Wechseln (versehentliches Tischberühren)
12. Jedes Tube mit Vortex-Gerät (anschliessend kurz zentrifugieren) oder Pipette mischen, Grösse & Inhalt der Tubes definiert Mischtechnik
13. Optische Kontrolle des pipettieren
14. Reverse Pipetting 2-3x
15. Innenseite eines Deckels & Rand von Tubes sollten nicht berührt werden & keine Flüssigkeitstropfen aufweisen
16. Kleinste Menge wird am Schluss pipettiert 

• Zonenkonzept um einzelne Arbeitsbereiche voneinander zu trennen, damit Produkt- & Personenschutz gewährleistet wird
• Handschuhe für Produkt & Personenschutz
• DNA-Exitus Plus das Reinigungsmittel wird in Zone 1&2 vor der Arbeit verwendet, um bereits vorhandene Nukleinsäuren zu entfernen
• Wechsel der Laborschürze zwischen Zone 2&4 und zwischen Zone 4&5, damit Produkt & Personenschutz gewährleistet wird

= Drei-Raum-Prinzip 

um Kontamination mit Mikroorganismen & Nukleinsäuren zu vermeiden, in jedem Raum separate Utensilien 

Raum 1 Reinraum(-zone) Mastermix (MM), keine Nukleinsäuren, Sicherheitswerkbank Klasse 2

Raum 2 Extraktionsraum Probenaufbereitung (Nukleinsäure-Isolierung), Zugabe Nukleinsäure zu Master-Mix (MM+DNA), normale Arbeitstische

Raum 3 Probenannahme

Raum 4 Amplifikationsraum Thermocycler, Real-Time PCR-Gerät, Sequenzieren, Arbeitstische neben Waschbereich

Raum 5 Detektionsraum Öffnen der PCR-Tubes, Gelenktrophorese, Arbeitstische Fenster & Kapelle

1. Extraktion der Nukleinsäure
2. Aufreinigung der Nukleinsäure 
3. PCR (Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts) Quanlitative & Quantitative PCR
4. Sequenzieren (Analyse der Nucleotidsequenz)

= Polymerase-Kettenraktion

Methode um Erbsubstanz (DNA) in vitro (=organische Vorgänge ausserhalb eines lebenden Organismus)

dazu wird Enzym DNA-Polymerase verwendet z.B. zur Erkennung von Erbkrankheiten, Virusinfektionen, erstellen & überprüfen genetischer Fingerabdrücke, klonieren von Genen & für Abstammungsgutachten

Zell-& Kernmembran müssen aufgebrochen werden, um DNA freizusetzen

• Proteine
• Lipide
• Zucker
• Mineralien (Salze)

Best. Enzyme die spezifische Arten von biologischen Molekülen verdauen.

• Proteasen spalten Proteine
• Detergenzien lösen Lipide auf
• Beta-Galactosidasen spalten Zucker

Die Chromosomale DNA wird durch Histone gebunden, andere assozierte Kernproteine können die DNA-Polymerase/Transkriptionsverfahren sein.

Transkriptionsfaktoren, kurz TF, sind regulatorische Proteine, die durch Bindung an spezifische Regionen in der DNA die Rekrutierung der RNA-Polymerase und den Start der Transkription positiv oder negativ modulieren.

In einer Waschmittellösung mischen (=Puffer)

Kalten Alkohol hinzufügen, bei 50°C inkubieren

Salz hinzufügen

Papierkorb Hygienemasken (in den weissen geschlossenen Papierabfall) 

Doppelsack Papiertücher aus der Tischdesinfektion, nicht kontaminierte Handschuhe

Stichfest blau Tischabfall mit Blutprodukten, kontaminierte Handschuhe

Stichfest gelb Spritzen

Salz in Kit ist Salz im AL integriert.

Lysiert Zellen, Phospholipide der Doppellipidschichten werden zerstört. Stabilisiert den pH-Wert. Chaotrope Salze entfernen die Hydrathülle & ermöglichen Salzbrücken zwischen der negativ geladenen DNA & der negativ geladenen Silikamatrix.

• enthält Waschmittel, das Phospholipid-Zellmembran & Kernmembran aufbricht, so dass DNA freigesetz werden kann
• enthält Puffermittel das pH-Wert aufrecht hält, so dass DNA stabil bleibt
• DNA & andere zelluläre Bestandteile wie Fett, Zucker & Proteine lösen sich darin auf

= Proteinverdauendes Enzym

Zerstört Peptidbindungen von Proteinen (Histone, DNasen, Transmembranproteine etc.)

• Entfernt Proteine welche an der DNA gebunden sind
• Zerstört zelluläre Enzyme die die DNA verdauen würden
• zur Sicherstellung dass die Menge an intakter DNA die extrahiert wird maximiert wird
• wird bei 50°C inkubiert

Natriumsalz Natriumazid wird als "preservative" (= Schutz gegen bakterielles Wachstum) eingesetzt

Aufgrund Phosphatgruppen auf DNA-Rückgrad negative elektrische Ladung, macht sich löslich wenn Salz hinzugefügt wird.

Die positiv geladenen Natriumionen des Salzes werden von der negativen Ladung der DNA angezogen, wodurch die elektrische Ladung der DNA neutralisiert wird, dadurch können die DNA-Moleküle zusammenkommen, anstatt sich gegenseitig abzustossen.

Präzipitation der DNA

durch Zugabe von kaltem Alkohol fällt DNA aus (=Ausfällung) der DNA wird Wasser entzogen, wodurch die Löslichkeit sinkt (in hohem Salzgehalt & Alkohol ist die DNA unlöslich) Der niedrige pH-Wert bei der Ethanolfällung wird durch die Zugabe von saurer Kaliumacetat- oder Natriumacetat-Lösung erzielt.

Ethanol ist nicht polar. Gibt man ihn zu dem Filtrat hinzu, wird die DNS unlöslich, beginnt zu verklumpen und wird als weißes fädiges Molekül sichtbar, die anderen Zellulären Substanzen bleiben in der Lösung.

Aus EDTA-Blut

Nein das EDTA-Blut kann direkt für die Extraktion verwendet werden.

• AL (Lysis Buffer) RT
• Protease 4°C Kühlschrank 
• Isopropanol 4°C Kühlschrank
• AW 1 (Wash Buffer) RT
• AW 2 (Wash Buffer) RT
• AE (Elution Buffer) RT

56°C

Der Tupfer kann Kontaminationen enthalten, da diese nicht steril verpackt sind. Eintauchtiefe von 2-4mm bei 1000er Kolbenhubpipetten beachten.

= Wash Buffer

Hohe Salzkonzentration für das Waschen der gebundenen DNA

= Wash Buffer

Tiefere Salzkonzentration für das Waschen der gebundenen DNA