Mikrobiologie 2. Semester - ZHAW

Wenn ein Test 100% sensitiv ist, dann gibt es keine falsch negativen Ergebnisse. Der Zielorganismus wird demnach sicher erkannt.

Als präsumtiv bezeichnet man die Kolonien, die das typische Bild der gesuchten Keims zeigen. Es sind Verdachtskeime. Als Bestätigt bezeichnet man MO, bei denen die Bestätigungsreaktion positiv ausfällt.

• PC-Agar
• Gusskultur mit 1ml Verdünnungslösung
• Bestätigung entfällt
• keine Selektion -> möglichst viele Erfassen

• Violet Red Bile Dextrose (VRBD)
• Oberflächenausstrich
• rot wachsende Kolonien
• 5 präsumtive Einzelkolonien werden neu bebrühtet und danach einem Oxidasetest unterzogen
• Enterobacteriacea sind oxidase negativ

• Mac Conkey Agar (MCA)
  • auch bekannt unter den Namen Monkey Agar (Nelissen'sche Namensgebung)
• Oberflächenausstrich
• Laktoseabbau wird nachgewiesen durch pH Indikator
• Gallensalze unterdücken Wachstum der meisten Gram+ und vielen Gram-
• Bestätigung entfällt

• Cetrimid-Nalidixinsäure-Agar (CNA)
• Oberflächenausstrich
• Begleitflora werden durch Vetrimid und Naladixinsäure stark unterdückt
• MgCl und KaSO4 unterstützen die Bildung von Pyocyanin (Sekundärmetabolit mit der Fähigkeit, andere Moleküle zu oxidieren und zu reduzieren und damit Mikroben abzutöten, die gegen P. aeruginosa konkurrieren)
• 5 präsumtive Kolonien werden einzeln einem  Oxidasetest unterzogen. Positive Ergebnisse werden unter aeroben Bedinungen bei 42°C während 1d auf Wachstum überprüft. (P.aeruginosa ist fakultativ anaerob)
• Angabe in sichtbar/nicht sichtbar

• Mannitol Salt Agar (MSA)
• Oberflächenausstrich
• Gelbe konvexe Kolonien, Farbveränderung von rot zu gelb durch metabolismus
• Angabe der Resultate als Staph. aureus pro g
• NaCl von 7.5% hemmt Begleitflora
• Mannitol wird abgebaut und führt zu einem pH-Abfall, wodurch die Farbe sich zu leicht geblich ändert

• Lactobacillus Agar (MRS-Agar)
• Oberflächenausstrich
• Förderung des Wachstums durch verschiedene Stoffe
• Fremdkeime wachsen nur sehr langsam
• Bestätigung mit Katalase Test mit mindesten 5 präsumtiven Kolonien
• Angabe des Resultats in KBE Lactobacillen/g

• Sabouraud-dextrose Agar (SDA)
• Oberflächenausstrich
• Mikroskopische Bestätigung
• Angabe in KBE/g
• Selektives Prinzip mit 4% Glucose und tiefem pH (hemmt Begleitflora)

klassische Taxonomie:

• Einordnung in Gruppen nach dem Prinzip der Ähnlichkeit
• Eigenschaften werden gewichtet
• Subjektives Verfahren
• Morphologische Eigenschaften (die Form betreffend) werden höher bewertet, sind auch einfach zu bestimmen

Numerische Taxonomie

• Bei der numerischen Taxonomie werden viele verschiedene Eigenschaften des MO erfasst
• Durch die "positiv" oder "negativ" Eigenschaft des MO kann eine Einteilung erfolgen
• alle Eigenschaften sind gleich gewichtet
• Auswertung oft mit dem Computer

Klassische

• Aufwendig durchzuführen (Mikroskop etc.)
• Schwierige Erkennung von MO in Mikroskop

Numerische

• NA

Einen schnellen, groben Überblick über die vorliegende Flora zu gewinnen

Vorteile:

• Ungefährer Überblick über die Flora der Probe
• Relativ einfach durchzuführende Tests

Nachteile

• Keim kann nur einer Familie oder im besten Fall einer Gattung zugeordnet werden
• Es können nur Reinkulturen analysiert werden (mit Dreiösenausstrich gewonnen)
• Die Probe muss eine gewisse viabilität haben, sprich sie darf nicht zu alt sein
  • Stoffwechselaktivitäten können sich mit einem fortgeschrittenen Alter vermindert sein ->falsche Ergebnisse

Familie oder teilweise bis Gattung (Genus)

• Es können nur Reinkulturen analysiert werden (mit Dreiösenausstrich gewonnen)
• Die Probe muss eine gewisse viabilität haben, sprich sie darf nicht zu alt sein
  • Stoffwechselaktivitäten können sich mit einem fortgeschrittenen Alter vermindert sein ->falsche Ergebnisse

• Makroskopische Beurteilung der Kolonien
• Gram-Verhalten
• Aminopeptidase-Test
• KOH Test
• Katalase-Test
• Cytochrom-Oxidase Test
• Oxidations-Fermentations-Test

• Beurteilung der Kolonien von blossem Auge oder mit einer Lupe
• Beobachtet werden:
  • Differenzierung der Kolonie
  • Farbe
  • Geruch
  • Oberfläche
  • Kolonierand
  • Profil (flach, erhoben etc.)

• MO werden mit Phasenkontrast angeschaut
• Morphologische Eigenschaften einzelner Zellen (Kokken, Stäbchen etc.)
• Zellverbände
• Beweglichkeit
• Endosporenbildung

• Mit Hitze oder Ethanol fixierte Zellen werden mit einem Farbstoff-Jod Komplex behandelt. Bei Gram negativen Keimen wird die Farbe bei der Spülung mit Ethanol wieder weggewaschen.
• Anschliessend erfolg die Gegenfärbung, beispielsweise mit Safranin
• Gram negative Bakterien erscheinen rosa bis rot, gram positive erscheinen dunkelblau bis violett.
• Es dürfen nur junge Zellen für den Test verwendet werden

• Alternative für Gram-Färbung (Gram-negative sind Aminopeptidase positiv)
• Indizierung der Gram-Eigenschaft von MO durch den Nachweis eines Enzyms
• Enzym spaltet das farblosen L-Alanin-4-nitroanilid in die beiden Bestandteile, die gelb sind.
• Ein Teststäbchen wird in 0.2 ml angeimpftes, dest. Wasser gegeben. Inkubation bei 37° während 10 min
• Achtung: Campylobacter bilden eine Ausnahme

• Die Zellwand von Gram-negativen Bakterien wird von 3%iger Kalilauge zerstört.
• Die DNA präzipitiert und kann anschliessend als Faden nachgewiesen werden

• Mit dem Katalase Test wird das Verhalten gegenüber Sauerstoff nachgewiesen.
• aerobe und fak. anaerobe Bakterien haben das Enzym Katalase, welches das H₂O₂ spalten kann
• Auf eine Probensuspension wird entwas H₂O₂ gegeben. Wenn sich dabei Luftblasen bilden, ist das Enzym Katalase vorhanden und das Bakterium ist aerob oder fak. anaerob
• -> muss innerhalb von 18-24 Stunden erfolgen

• Mit diesem Test wird das Cytochrom-Oxidase-System nachgewiesen. Dieses katalysiert den letzten Schritt der Atmungskette
• Mit dem Kovax-Reagens wird das möglicherweise vorhandene Cytochrom-C reduziert.
• Das oxidierte Reagens ist tiefblau statt farblos
• Mit einer Impföse wird Bakterienmaterial auf den Teststreifen gegeben und nach 15 Sekunden abgelesen (Vorsicht, nach 15 sek sind falsch positive Ergebnisse durch Luftsauerstoff möglich)

• Mit dem Test wird der fermentative oder oxidative Abbau von Kohlenhydraten nachgewiesen
• Zusätzlich wird getestet, ob eine Gas- oder Säurebildung stattfindet
• Ein Basal Medium, das 1% Glucose enthält, wird mit der Kultur angeimpft.
• Dabei wird ein Röhrchen mit einer sterilen Paraffinschicht gegen Sauerstoff abgedichtet ->Nachweis fermentativ
• Farbveränderungen des Mediums (ausgehend von Grün) sagen über den Glucoseabbau und die Säurebildung (Gelb) etwas aus, die Bildung von Aminen und Ammoniak färbt das Medium blau
• Bebrütung bei 48 Stunden bei 37°

Bei der aktiven Lufkeimmessung wird eine definierte Menge Luft auf einen Nährboden gesogen, auf welchem die  MO hängen bleiben (Impaktionsverfahren). Sie liefert quantitative Ergebnisse.

Eine andere Möglichkeit ist, die Luft in eine Flüssigkeit zu leiten, aus der anschliessend eine Verdünnungsreihe angelegt wird (Zyklonverfahren). Es gibt auch Verfahren, bei denen die Luft durch einen Filter gezogen wird, der anschliessend Inkubiert wird.

Reinräume im Pharmabereich sind mit Partikelzählern ausgestattet, die bei zu hohen Zahlen Alarm schlagen.

Passive Luftkeimmessungen liefern qualitative Ergebnisse. Partikel sedimentieren mit der Zeit auf die offen ausgelegten Platten. Die Untersuchung dauert meistens 30 minuten.

Es können damit einfach Bewegungen oder andere Einflüsse beobachtet werden.

Abklatschverfahren:

• Keimzahlbestimmung auf glatten oder leicht gekrümmten Oberflächen
• Keimzahlbestimmung von Händen
• halbquantitative Aussagen
• selektive Nährmedien möglich

Tupferverfahren:

• Keimzahlbestimmung auf schlecht zugänglichen Bereichen oder stark gewölbten Oberflächen
• Definierte Fläche wird mit dem Tupfer kräftig abgerieben
• selektive Nährmedien möglich
• halbquantiative Aussagen

• Hygienekontrolle nach Reinigung/Desinfektion
• Bestimmung des Hygienestatus von CIP-Einrichtungen
• Wenn schnelle Ergebnisse über den Reinheitsgrad erwünscht sind
• Es werden Fail und Pass Werte festgelegt (RLU, Relative Luminescence Unit)
• Untere Nachweisgrenze bei 40 KBE/cm²

Spül/Rollflaschenmethode:

• Sterile Flüssigkeit wird mehrmals geschüttelt, dann kultiviert (verschiedene Methoden)
• Rollflasche: Agarnährboden in Flasche aufgetragen, ausgewertet
  • viel Platzverbrauch

Abschwemmverfahren:

• Werkzeug/Gerät in steriles Peptonwasser, mit Ultraschall für bessere Ausbeute, dann Membranfiltration

• Wachstumsverhalten eines Mikroorganismus ist von zentraler Bedeutung
• Kultivierung erfolgt meist in Flüssigmedium

• Auszählung mit dem Mikroskop
• Messung der Trübung (Optische Dichte) des Mediums

• Kontroll-Agarplatte, die ein Elektiv-Selektiv Medium darstellt (Oberflächenausstrich)
• (Dreiösen-Ausstrich)

\(v = {{\log(t_{2})-\log(t_{1})\over \log2}\over \Delta t_{1,2}}\)

v =  Wachstumsrate/Generationszeit

t1 und t2 müssen während der exponentiellen Wachstumsphase gewählt werden.